Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:    УДК 617.713

DOI: https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-27-32

Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте


1НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ
2Калужский филиал «НМИЦ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ
3Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
4НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук

    Актуальность

     Одним из наиболее тяжелых и социально значимых заболеваний, связанных с нарушением работы ретинального пигментного эпителия (РПЭ), является возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – это хроническое прогрессирующее дистрофическое заболевание центральной зоны сетчатки, приводящее к постепенному снижению зрения [1].

    ВМД является третьим заболеванием в мире, приводящим к слепоте (по данным ВОЗ), встречается у 20% населения старше 50 лет, а частота распространения в России составляет 15 случаев 1000 чел. [2].

    На сегодня существует ряд методик лечения ВМД:

    1) метаболическая терапия биодобавками и поливитаминными комплексами – может быть эффективна на начальных стадиях заболевания [3];

    2) интравитреальное введение anti-VEGF-препаратов – эффективно подавляет процессы неоангиогенеза, однако данный вид лечения в ряде случаев не приводит к значимому улучшению зрения, является дорогостоящим, требует неоднократных инъекций и при этом не исключается риск рецидива неоваскуляризации [4];

    3) фотодинамическая терапия и хирургическое иссечение субретинальных фиброваскулярных мембран (СНМ) – данные методики также зачастую не приводят к существенному улучшению зрения и больше направлены на сохранение остаточных зрительных функций [5, 6].

    Новым перспективным методом лечения ВМД является трансплантация РПЭ в форме суспензии клеток [7] или клеточного монослоя на мембране Бруха [8] через трансцилиарный [9] или транссклеральный доступы [10].

    По нашему мнению, более современной формой трансплантата РПЭ является многоклеточный сфероид – это форма 3D-клеточной культуры, в которой клетки приближены к условиям нативной ткани.

    3D-сфероиды РПЭ могут иметь диаметр от 50 до 700 мкм, на плоской поверхности проявляют адгезию и спрединг (распластывание с образованием клеточного слоя), что позволяет снизить вероятность их диссеминации.

    Так же в сфероидах наблюдается разделение клеток по слоям – поверхностные клетки проявляют эпителиальный фенотип, а центральные – мезенхимальный, что позволяет снизить риск эпителиально-мезенхимального перехода [11].

    Однако трансплантация РПЭ в форме 3D-сфероидов требует проведения доклинических исследований. На сегодня традиционной моделью для офтальмологических исследований являются кролики.

    Однако в доступной литературе отсутствуют работы, описывающие технику выделения кроличьего РПЭ, его культивирования для создания 3D-сфероидов и методику их трансплантации.

    Цель

    Разработать технологию конструирования и технику трансплантации 3D-сфероидов РПЭ на глазах экспериментальных животных.

    Материал и методы

     1. Этап исследований in vitro. I этап исследования включал в себя серию экспериментов in vitro. Все этапы проводились на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем головной организации МНТК.

    После энуклеации глазных яблок (n=4) у кроликов породы шиншилла выделяли хориоидально-пигментный комплекс, укладывали на чашку Петри и заливали 5 мл питательной среды. Состав питательной среды: DMEM/F12 – 88% (Sigma, США); ЭТС (HyClone, США) – 10%; Глутамакс (Gibco, США) – 1%; раствор антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, амфоцетрин В), (Sigma, США) – 1%. Культивирование осуществлялось при стандартных условиях – 5% CO2, t=37° С. Смена питательной среды проводилась каждые 3 дня. По достижению полной конфлюентности клетки РПЭ переносились в агарозные планшеты в расчете 1000 клеток на 1 сфероид.

    Для иммуноцитохимического исследования полученные 3D-культуры сфероидов изучали на 3-е, 7-е и 11-е сутки сфероидогенеза (лазерный сканирующий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония). Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров (Alexa Fluor, Великобритания), таких как: RPE-65 (высокоспецифичный маркер пигментного эпителия), ZO-1 (белок запирающих межклеточных контактов), цитокератин 8, 18 (белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток), а также мезенхимального маркера виментина. Для идентификации указанных маркеров использовали вторичные антитела AlexaFluor 488, 594 (Abcam, Великобритания).

    2. Этап исследований in vivo. II этап исследования проводился на базе Калужского филиала МНТК и включал в себя трансплантацию полученных клеточных культур 10 кроликам породы шиншилла (10 глаз).

    Клеточные трансплантаты перевозились в условиях гипотермии (+4° С). Перед операцией всем экспериментальным животным промывали конъюнктивальную полость раствором Пиклоксидина 0,05%. Всем кроликам в качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора Гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли 3-кратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,5% раствора Проксиметакаина. Под контролем операционного микроскопа «Opton» CFC-6 (Германия) проводили лимбальную перитомию, в 2 мм от лимба на 2, 8 и 10 часах устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела для входа эндовитреального инструментария и инфузионной системы. Фиксировали инфузионную систему, вводили световод, витреотом выполняли центральную витрэктомию (2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт.ст.), (Alcon, Accurus, США). Далее острой канюлей 39G делали ретинотомическое отверстие выше места центральной зоны сетчатки. Устройство для введения клеточных трансплантатов представляет из себя шприц, подключаемый к аппарату для комбинированной хирургии (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). При нажатии на педаль поршень шприца начинает ход, и сфероиды (n=81), находящиеся в жидкой среде (0,05 мл BSS+), доставляются субретинально. Операции заканчивались заменой жидкости на воздух и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву. Эндолазерная коагуляция вокруг ретинотомического отверстия не проводилась.

    В послеоперационном периоде всем кроликам проводилась стандартная антибактериальная и противовоспалительная терапия в течение двух недель.

    В качестве методов контроля экспериментальным животным в послеоперационном периоде проводили ультразвуковое В-сканирование глаза – 1 сутки (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическую когерентную томографию (ОКТ) – 3, 7, 10, 14, 20 сутки (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Германия).

    Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировались и фиксировались в 10% растворе формалина для последующего гистологического исследования.

    Результаты

     1. Этап исследований in vitro. Из трупных кроличьих глаз через 14 дней после начала культивирования было получено 1,12х106 клеток РПЭ, из которых в последующем было сконструировано 1100 3D-сфероидов.

    В ходе культивирования была отмечена постепенная компактизация полученных 3D-сфероидов, и к 7 суткам наблюдалось образование гладких сфероидов, их диаметр в среднем составлял от 80 до 90 микрон. Дальнейшее культивирование не приводило к изменению размеров, что свидетельствовало о завершении процесса сфероидогенеза.

    При проведении иммуноцитохимического окрашивания полученных 3D-культур отмечалось наличие ярко выраженной экспрессии характерного высокоспецифичного маркера пигментного эпителия сетчатки RPE-65, а также эпителиальных маркеров цитокератина 8, 18 и ZO-1. При этом отмечалась стабильная экспрессия указанных маркеров на всем периоде культивирования (3, 7 и 11 сутки). Кроме того, экспрессия мезенхимального маркера виментина была слабой, что свидетельствует о преимуществе 3D-культивирования эпителиальных клеток для сохранения их фенотипа.

    В связи с необходимостью перевозки донорского материала была изучена жизнеспособность сфероидов после пребывания при температуре +4° С в течение 4 часов. Оценка жизнеспособности осуществлялась путем изучения адгезивных свойств сфероидов и методом флюоресцентного окрашивания маркером «Live and Dead» (Abcam, Великобритания). Было выявлено сохранение жизнеспособности сфероидов вплоть до 7 суток наблюдения. Таким образом, нами были определены оптимальные сроки предтрансплантационного культивирования 3D-сфероидов РПЭ.

    2. Этап исследований in vivo. В первые сутки после оперативного вмешательства на всех прооперированных глазах клиническая картина была схожей: отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, швы конъюнктивы были адаптированы, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, влага передней камеры прозрачная, радужка спокойна, выраженных помутнений хрусталика не наблюдалось. При проведении ультразвукового В-сканирования в 1 сутки у 6 кроликов отмечалась плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у 4 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не визуализировалась. Уровень воздуха составлял менее ½ объема витреальной полости.

    ОКТ-картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных: в зоне оперативного вмешательства отмечался кистозный отек и плоская отслойка сетчатки. Данные изменения отмечались в течение первых 7 суток после хирургии. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также на 3, 7 и 10 сутки субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм – предположительно 3D-сфероиды РПЭ. При проведении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологического состояния сетчатки не наблюдалось.

    По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.

    Обсуждение

    На сегодня в мировой офтальмологической практике большинство попыток трансплантации РПЭ выполняются через трансцилиарный доступ при помощи эндовитреального хирургического инструментария [12]. Это позволяет доставить клеточные трансплантаты в необходимую зону под визуальным контролем (в отличие от транссклерального доступа).

    В большинстве случаев используется донорский аллогенный РПЭ [13], так как для трансплантации аутологичного РПЭ необходимо индуцировать отслойку сетчатки и с периферических отделов выкроить участок сосудистой оболочки с пигментным эпителием [14]. Данный вид вмешательства является травматичным, и в послеоперационном периоде существует высокий риск таких осложнений, как отслойка сетчатки, гемофтальм, пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) [15]. Также после индукции отслойки сетчатки необходимо проведение тампонады витреальной полости силиконовым маслом, что подразумевает проведение второго этапа операции по поводу его удаления.

    При проведении трансплантации аллогенного РПЭ клеточные транспланты можно условно разделить на 2 вида: суспензия клеток и лоскут «хориодея + РПЭ».

    По данным литературы, при трансплантации суспензии клеток РПЭ большинство клеток диссеминируют в витреальную полость через ретинотомическое отверстие и не замещают дефект в РПЭ реципиента вследствие неравномерного распределения по субретинальному пространству. Также, попадая в витреальную полость, могут вызывать развитие ПВР, эпиретинальный фиброз и отслойку сетчатки [16].

    Для трансплантации лоскута «хориоидея + РПЭ» необходимо выполнять ретинотомическое отверстие диаметром не менее 2 мм, уложить трансплантат нужной стороной вверх, расправить и провести эндолазеркоагуляцию ретинотомического отверстия. Данное вмешательство является более травматичным, требует дальнейших разработок нового инструментария для введения трансплантата, всегда существует риск укладки лоскута слоем РПЭ вниз, возможна травматизация лоскута. Также не исключается риск развития ПВР, эпиретинального фибороза и отслойки сетчатки, и зачастую требуется введение силиконового масла [17].

    Таким образом, основными требованиями, предъявляемыми к трансплантации РПЭ, являются малоинвазивность, снижение риска диссеминации клеток в витреальную полость, отсутствие необходимости в введении силиконового масла.

    В ходе проведения инструментальных методов исследования в послеоперационном периоде нами было показано, что осложнения (плоская локальная отслойка сетчатки, кистозный отек сетчатки), вызываемые предложенной в работе хирургической техникой, являются неопасными и обратимыми.

    При офтальмоскопии и В-сканировании в послеоперационном периоде ни у одного кролика не было отмечено развитие ПВР, следовательно, сфероиды РПЭ после трансплантации быстро адгезируются к сосудистой оболочке и не диссеминируют в витреальную полость.

    Ретинотомическое отверстие, выполняемое канюлей калибра 39G, не требует проведения эндолазеркоагуляции сетчатки. Введения силиконового масла также не потребовалось ни в одном случае.

    Предложенную хирургическую технику можно считать микроинвазивной и малотравматичной.

    Выводы

    1. Предложенная технология культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позволяет сохранить эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается данными иммуноцитохимических исследований.

    2. Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ является приемлемой, что подтверждается данными оптической когерентной томографии и гистологическими исследованиями.

    3. Предложенная хирургическая техника субретинальной трансплантации 3D-сфероидов РПЭ является перспективной для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику.


Страница источника: 27-32


Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)

XVII Всероссийская школа офтальмологаXVII Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Top.Mail.Ru


Open Archives