Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Самойлов Александр Николаевич
Официальные оппоненты:
Полунина Елизавета Геннадьевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО ИПК ФМБА России.
Майчук Дмитрий Юрьевич, доктор медицинских наук, заведующий отделом терапевтической офтальмологии ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ.
Общая характеристика работы
Актуальность исследования
В мире приблизительно 1,3 млрд человек живут с той или иной формой нарушения зрения вдаль или вблизи [Bourne R.R.A., Flaxman S.R. et al., 2017]. По данным информационного бюллетеня Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «Нарушения зрения и слепота», около 80% случаев нарушения зрения считаются предотвратимыми, а одной из основных причин развития слепоты является патология роговицы. В частности, язва роговицы и ее исходы — находятся на четвертом месте среди причин слепоты во всем мире [Srinivasan M., Gonzales C.A. et al. 1997, Tena D., Rodríguez N., et al., 2017, Давлетшина Н.И., Самойлов А.Н., 2020].
Инфекционные кератиты — группа полиэтиологических заболеваний, в основе которых лежит воспаление слоев роговицы. Структура инфекционных кератитов существенно варьирует между географическими регионами и даже между отдельными областями одной и той же страны. Ряд авторов сообщают об увеличении доли грибковых кератитов в последние десятилетия [Kredics L, Narendran V., et al., 2015, Bograd A., Seiler T., et al., 2019, Liu H.Y., Chu H.S., et al., 2019, Ковалева Л.А., Кричевская Г.И., 2019, Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И., 2020, Hoffman J.J., Matthew J., Burton M.J., et al, 2021, Обрубов А.С. 2022]. Если предположить, что все случаи с отрицательным микробиологическим посевом являются грибковыми, ежегодная заболеваемость составит 1 480 916 случаев (1 036 641–1 925 191). Подсчет глобальных случаев удаления глаз в результате агрессивного офтальмомикоза выявил, что к данному методу прибегают в 8–11% случаев, что представляет собой ежегодную потерю 84 143–115 697 глаз [Brown L., Leck A.K. et al., 2020]. Примерно 10–25% случаев кератомикозов осложняются перфорацией или требуют хирургического лечения, в то время как по крайней мере 60% пациентов, даже после лечения, остаются монокулярно слепыми, что соответствует примерно 800 000 человек на 1 год. [Burton M.J., Pithuwa J. et al., 2010; Thomas P.A., Leck A.K., Myatt M., 2005; Prajna N.V.; Krishnan Т., et al., 2016, Ковалева Л.А., Кричевская Г.И., 2022]. В 2015, 2020 гг. опубликованы значимые глобальные эпидемиологические обзоры данных о заболеваемости грибковым кератитом в разных странах начиная с 1962 г. [Kredics L., Narendran V., et al., 2015, Brown L., Leck A.K. et al., 2020]. Своевременная, адекватная диагностика и лечение могут сохранить зрение.
В отечественной литературе нет данных о широких национальных исследованиях эпидемиологии грибковых кератитов, сведения ограничены публикациями отдельных институтов и медицинских учреждений [Пятышина О.В., Якуба А.В. и др., 2017, Скрябина Е.В., Астахов Ю.С. и др. 2018, Ковалева Л.А., Кричевская Г.И., 2019-2022, Сомова В.В., Новицкая И.В., 2020, Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И., 2020].
По данным локального исследования, с августа 2018 г. по январь 2020 г. на лечении находилось 12 пациентов с подтвержденной в последующем грибковой этиологией. Ведущим патогеном явились грибы рода Fusarium. В большинстве случаев эффективными препаратами, по спектру чувствительности, оказались вориконазол, нистатин, итраконазол, и в 100 % случаев – тербинафин. [Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И., 2020].
Экспериментальные модели грибкового поражения роговицы необходимы для изучения антимикробного действия, эффективности и токсичности на животных моделях инфекции [Sande M., 1999]. Принято выделять следующие группы моделей: 1) in vivo, в которых объектом исследования является живое животное; 2) in vitro, в которых один или несколько типов клеток культивируются изолированно; 3) ex vivo, при которых исследуемая ткань эксплантируется и исследуется в чашке Петри [Montgomery ML, Fuller KK, 2020].
По исследовательским данным, лечение кератомикозов чаще всего производится натамицином и вориконазолом [Iyer S.A., Tuli S.S. et al., 2006, Ansari Z., Miller D., Galor A., 2013, Sun C.Q., Lalitha P., et al., 2014, Скрябина Е.В., Астахов Ю.С. и др., 2017, Обрубов А.С., Бельская К.И., 2018, Bograd A., Seiler T. et al., 2019, Sharma N., Sahay P. et al., 2019, Castano G., Elnahry A.G. et al., 2022]. Самой известной офтальмологической формой антимикотика является 5% раствор натамицина (оригинальный препарат Natacyn, Novartis, США), преимущественно эффективный при мицелиальных грибах [Sun C.Q., Lalitha P., et al., 2014, Farrell S., McElnea E. et al., 2017, Brown L., Leck A.K. et al., 2020]. На его базе на фармацевтическом рынке представлены многочисленные эквиваленты, которые можно приобрести в США, некоторых странах Европы и СНГ, Индии (Natamet, Natak, N-Mycin и другие). Имеются данные о неэффективности первичного лечения натамицином в 31,3% случаев. [Lalitha P., Prajna N.V. et al., 2006]. Лечение вориконазолом и другими антимикотическими средствами производится перорально, парентерально и инстилляционно off label ввиду отсутствия коммерческих сертифицированных лекарственных форм для местного применения в офтальмологии.
Изложенные положения определяют актуальность разработки воспроизводимой модели грибкового кератита и экспериментального обоснования применения препарата тербинафин при кератомикозах.
Цель настоящей работы: обосновать применение противогрибкового препарата тербинафин при грибковом поражении роговицы, вызванным грибами рода Fusarium.
Задачи
1. Создать экспериментальные модели грибкового кератита и язвы, вызванных грибами рода Fusarium.
2. Изучить проникающую способность 0,1% суспензии тербинафина в слои роговицы в эксперименте in vivo.
3. Определить влияние противогрибкового препарата тербинафин на структурные характеристики роговицы при грибковом поражении роговицы с использованием ОКТ ПОГ и морфологических исследований.
4. Проанализировать результаты эффективности применения 0,1% суспензии тербинафина на экспериментальной модели грибкового кератита и язвы роговицы, вызванных грибами рода Fusarium.
Научная новизна
1. Созданы 2 экспериментальные модели грибкового кератита и кератоувеита у кроликов, позволяющие изучать течение грибкового поражения роговицы при заражении грибами рода Fusarium spp.
2. Впервые на экспериментальных моделях грибкового кератита и кератоувеита разработана рабочая концентрация, показана безопасность, эффективность, изучена проницаемость раствора тербинафина.
3. Впервые изучено воздействие экспериментального лечения тербинафином на клинические, культуральные показатели и морфологические изменения роговичной ткани у лабораторных животных.
4. Впервые на основании полученных данных оценена возможность применения 0,1% суспензии тербинафина для изучения в клинических исследованиях.
Практическая и теоретическая значимость
1. Новые экспериментальные модели грибкового кератита разработаны с учетом актуальной грибковой флоры, достоверно воспроизводимы, позволяют изучать особенности развития патологического процесса, формирования язвенного дефекта грибковой природы, оценивать результаты различных способов лечения.
2. На основании клинического, культурального и морфологического исследования выявлена безопасность и эффективность действия противогрибковой офтальмологической суспензии тербинафина, установлена достоверная санация грибковой инфекции в эксперименте, быстрая регенерация и купирование язвенного процесса в течение 3-4 дней.
3. Полученные данные показали эффективность экспериментальной терапии грибковых поражений роговицы у кроликов, что может позволить начать консервативную терапию в ранние сроки, достичь своевременной санации чувствительной грибковой микрофлоры из слоев роговицы, предотвратить риски перфорации и распространения инфекции в глубжележащие отделы глаза, сократить длительность заболевания.
4. На основании полученных данных оценена возможность доклинического исследования 0,1% суспензии тербинафина для лечения кератомикозов.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне проспективного экспериментального когортного исследования с использованием экспериментальных, клинических, инструментальных и статистических методов.
Положения, выносимые на защиту
1. Новые экспериментальные модели кератомикоза созданы с учетом клинически значимой грибковой флоры, имитируют течение грибкового поражения роговицы у человека, являются 100% воспроизводимыми.
2. 0,1 % суспензия тербинафина является безопасным и эффективным препаратом для лечения кератомикоза, что подтверждено клиническими, культуральными и морфологическими методами исследования в эксперименте.
3. Полученные результаты могут быть предложены в качестве доклинического этапа исследований препарата для лечения кератомикозов.
Степень достоверности и апробация работы
Степень достоверности проведенных результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным объемом выборки экспериментальных животных, клинически достоверных признаков заражения, обследования и лечения с использованием современных клинико-инструментальных и культуральных методов обследования. Методы статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам. Сформулированные в диссертации выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из результатов многоуровнего анализа.
Апробация работы
Результаты научно-исследовательской работы были успешно доложены и обсуждены на заседании общества офтальмологов РТ (г. Казань, 2019 г.), заседании общества офтальмологов ЧР (г. Чебоксары, 2019 г.), Заседании первичной организации врачей-офтальмологов ГАУЗ "РКОБ МЗ РТ им.проф. Е.В.Адамюка, структурного подразделения НП "Ассоциация медицинских работников Республики Татарстан" (г. Казань, 2020, 2021, 2022 гг.). Конференциях «Новые технологии в офтальмологии» (Казань 2021, 2022, 2023 гг.), Всероссийской научно-практической конференции «Грибковые поражения глаз» (г. Калуга, 2021), два доклада представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фёдоровские чтения» (г. Москва, 2022 г., 2023 г.), Всемирном офтальмологическом конгрессе (г. Орландо, США, 2022 г.), Всероссийской конференции "Воспаление глаза" (г. Москва, 2022 г.), Международном Офтальмологическом Конгрессе «Белые Ночи» (г. Санкт-Петербург, 2023).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе – 4 в центральных рецензируемых журналах из списка ВАК, 2 практических руководства (под редакцией акад. РАН В.В. Нероева; д.м.н. И.А. Лоскутова) ., получено 3 патента РФ: патент RU 2746647C1 от 19.04.2021; патент № 2768476 от 24.03.2022; патент № 2802388 от 28.08.2023.
Внедрение результатов работы
- Высокая эффективность экспериментального лечения кератомикозов офтальмологической 0,1% суспензией тербинафина у кроликов возможно свидетельствует о перспективности применения данного способа лечения в клинической практике.
- Данная работа может быть рассмотрена как этап клинических испытаний нового офтальмологического противогрибкового препарата.
- Результаты исследования внедрены в практику ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ГАУЗ «Республиканская клиническая офтальмологическая больница Министерства здравоохранения» Республики Татарстан; в образовательные программы кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 155 источников (40 отечественных и 115 зарубежных).
Содержание работы
Материалы и методы
Работа выполнялась в период 2019-2023 гг. на базе кафедры офтальмологии (заведующий кафедрой – д.м.н., профессор Самойлов А.Н.) Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ректор ФГБОУ ВО Казанский ГМУ – д.м.н., профессор Созинов А.С.). Исследования включали два этапа.
-Первый этап включал изучение структуры этиологии и антимикробной чувствительности рефрактерных кератитов в серии клинических случаев пациентов, находящихся на лечении в ГАУЗ «РКОБ МЗ РТ» им. проф. Е.В.Адамюка, культуральное исследование проведено на базе микологической лаборатории ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» (КНИИЭМ).
-Второй этап содержал ряд экспериментальных исследований, включающих создание экспериментальных моделей грибкового воспаления роговицы, разработку офтальмологической суспензии тербинафина с изучением эффективной концентрации, безопасности и токсичности, сравнительное исследование эффективности с другим противогрибковым препаратом, клинико-лабораторные и морфологические методы диагностики, так же изучена проницаемость 0,1% суспензии тербинафина в слои роговичной ткани. Данный этап исследований проводили совместно с микологической лабораторией КНИИЭМ; кафедрой микробиологии, кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ»; АО «Татхимфармпрепараты»; институтом органической и физической химии (ИОФХ) им. А. Е. Арбузова (обособленное структурное подразделение ФГБУН "Федеральный исследовательский центр "Казанский научный центр РАН) (лаборатория химико-биологических исследований; коллективный спектро-аналитический Центр изучения строения, состава и свойств веществ и материалов), на базе центра экспериментальной хирургии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. Офтальмологические методы исследования проведены на базе клиники «КОРД».
Статистические методы анализа результатов исследования
Статистическая обработка материалов исследования осуществлена автором самостоятельно с применением параметрического и непараметрического анализа. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2019. Статистический анализ проводился с использованием свободной программной среды вычислений R (v.4.2.1).
Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50).
Анализ этиологии и антимикробной чувствительности грибковых кератитов. Отрицательные результаты посевов по результатам культурального исследования мазка с роговицы у пациентов с рефрактерным течением кератита – при активном воспалительном течении, углублении язвы, продолжающемся лизисе стромы, перфорации, явились поводом для углубленного диагностического анализа. Диссертантом самостоятельно проведен анализ этиологической структуры инфекционных кератитов у курируемых пациентов, организация исследования антимикробной чувствительности in vitro, поиск и сравнение результатов разных микологических лабораторий. По данным собственного анализа, Fusarium spp. явился основным возбудителем грибковых кератитов у пациентов, а самая высокая чувствительность грибковых агентов, относящихся к разным родам, выявилась к веществу тербинафин (таб.1) [А.Н. Самойлов, Н.И. Давлетшина, 2020].
Для решения поставленных задач были разработаны экспериментальные модели грибкового кератита с применением данных собственного исследования на кроликах породы «шиншилла». Эксперименты in vivo одобрены ЛЭК ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ» МЗ РФ (№ 1 от 4.02.2020 года).
Экспериментальные исследования
Экспериментальная модель грибкового кератоувеита.
Экспериментальное моделирование выполнено автором самостоятельно. Экспериментальные исследования выполнены совместно с сотрудниками лаборатории микологии КНИИЭМ; АО «Татхимфармпрепараты»; ИОФХ им. А. Е. Арбузова.
По причине отсутствия стандартных воспроизводимых экспериментальных моделей грибкового кератита, вызванных актуальными грибами рода Fusarium spp., с целью экспериментального обоснования эффективности тербинафина, в ходе настоящего исследования диссертантом с соавторами разработаны новые способы получения грибкового кератита и кератоувеита с язвой роговицы, по которым получено 2 патента на изобретение [Самойлов, А.Н., Давлетшина Н.И. и др., 2021-2022].
Для приготовления инокулюма использованы чистые, 5 суточные культуры грибов Fusarium solani, выросшие на плотной питательной среде Сабуро. Инокулят предварительно растерт в ступке. В стерильном изотоническом растворе хлорида натрия приготовлена взвесь микроорганизмов с конечной плотностью 1,0×10 в 6 клеток/мл, что соответствует 0,5 MF (измерение денситометром согласно данным изготовителя стандартов мутности bioMerieux).
После предварительных этапов подготовки с применением 5% спиртового раствора формалина, последующими инстилляциями 0,1% глазных капель дексаметазона, через 3 дня под местной инстилляционной анестезией производили скарификацию эпителия роговицы. Далее при помощи инсулинового шприца с интегрированной иглой 29G интрастромально вводили 0,1 мл 10 в 6 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., инстиллировали 2-3 капли 99% концентрата димексида. В завершение, орошали роговицу 10 в 6 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзой наносили 0,2-0,3 мл этой же суспензии, надевали мягкую контактную линзу (МКЛ) на роговицу. Производя дополнительные процедуры заражения роговицы с частотой через 1 день, за 5-6 подходов, на 12-14-й день получили глубокий грибковый гипопион-кератоувеит с изъязвлением роговицы (рис. 1,2,3). На 16-й день без лечения формировалась перфорация роговицы (рис. 4)
Обоснование применения тербинафина для лечения кератомикозов.
Тербинафин отвечает критериям как высокоэффективный, максимально безопасный и оптимальный по фармакоэкономическим показателям препарат. Успех применения обусловлен его высоким спектром микологической активности, низкой токсичностью, фармакокинетическим профилем и фармакоэкономическим показателям, что сказывается на его доступности [Ю.Б.Терехова, А.Ю.Миронов, 2010].
На базе лаборатории микологии КНИИЭМ автором совместно с к.б.н., доц. Лисовской С.А. проведено экспериментальное определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) тербинафина по отношению к мицеллярным грибам, выявленных культурально у пациентов с окуломикозами. Рост микрофлоры на жидкой питательно среде Сабуро зафиксирован на 4-й день. МИК Trb для грибoв рода Alternaria – 0,78 мкг/мл, Paecilomyces и Aspergillus – 1,5 мкг/мл, рода Fusarium oxysporum – 3,12 мкг/мл, Fusarium moniliforme – 6,25 мкг/мл (0,000625%) (таб.2).
На базе АО «Татхимфармпрепараты» при разработке лекарственной формы автором совместно с к.х.н. Анисимовым А.Н., Айдовой А.В. установлена концентрация тербинафина, способствующая равномерному его распределению, которая составила 1000 мкг/мл (0,1%), что и было взято в основу экспериментального исследования.
Результаты исследования проницаемости суспензии тербинафина через слои роговицы.
На базе коллективного спектро-аналитического Центра изучения строения состава и свойств веществ и материалов ИОФХ им. А. Е. Арбузова автором совместно с к.х.н. Ризвановым И.Х. изучена диффузия 0,1% суспензии тербинафина через ткани. Исследование проводили на газовом хроматографе Agilent 6890N/5973 с масс-селективным детектором Agilent 5973N (рис. 5,6). Как известно, эпителий роговицы является биомеханической структурой, обеспечивающий адгезию или барьер лекарственных веществ. Парацеллюлярная диффузия ионных (полярных) молекул предотвращается плотными контактами роговицы, тогда как липофильные препараты могут легко диффундировать через липофильную роговицу по трансцеллюлярному механизму [Ramsay E., Eva M. del Amo et al., 2018]. По этой причине диффузия 0,1% гидрофильной суспензии тербинафина исследована в условиях деэпителизированной роговицы.
В испытуемом образце (влага передней камеры) тербинафин в концентрации выше 0,01% в растворе не обнаружен. В контрольном образце (проба с поверхности конъюнктивы) через 30 мин. после инстилляции тербинафин обнаружен в количестве 0,1% (рис.7). Результаты токсикологического исследования.
Оценку токсичности и раздражения глаз проводили в соответствии с принципом оценки раздражения глаз по тесту Дрейза. Тест включает оценку прозрачности роговицы, наличия отека радужки, гиперемию конъюнктивы, отек конъюнктивы, отделяемое из конъюнктивы. После каждой инстилляции 0,1% суспензии тербинафина наблюдали симптомы раздражения глаз у кроликов, такие как частое моргание, светобоязнь, слезотечение и т.п., состояние оценивали при биомикроскопии через 1 ч., 12 ч., 24 ч., 48 ч., 72 ч., и 14 дней. Дополнительно оценивали повреждение эпителия под синим светом с окрашиванием флуоресцеином натрия. В каждом случае фиксировали по 0 баллов, что свидетельствовало об отсутствии симптомов раздражения, в то время как максимальный балл в тесте может достигать 16.
Изучение токсикологической безопасности выполнено автором совместно с д.б.н., профессором Зобовым В.В. на базе лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А. Е. Арбузова в экспериментах in vitro на клеточных линиях человека Chang Liver (клетки печени) и Wi-38 (эмбриональные клетки фибробластов легкого) и in vivo на мышах линии. CD-Показатель цитотоксичности составляет от 20 до 84 мл/л, или от 20 до 84 г/л, что позволяет считать этот препарат практически не токсичным. В исследованиях in vivo на мышах CD-1 показало, что в соответствии с классификацией, 0,1% суспензию тербинафина можно отнести к VI классу, или относительно безвредных веществ. При однократном пероральном и внутрибрюшином введении в дозах 20 мл/кг (20 г/кг), препарат не вызывает гибели и каких-либо отрицательных эффектов на животных.
Результаты оценки течения воспалительного процесса при лечении 0,1% суспензией тербинафина экспериментального кератомикоза.
Исследование эффективности суспензии тербинафина проводилось в серии экспериментов in vitro и in vivo. Серия экспериментальных исследований in vivo проведена на 30 кроликах (45 глаз) породы «шиншилла», в которых изучение эффективности суспензии тербинафина провели на 25 глазах:
1 серия – изучение эффективности тербинафина на 15 кроликах – 15 глаз;
2 серия – изучение эффективности тербинафина в группах сравнения – на 15 кроликах (30 глаз):
1) 5 кроликов (10 глаз) – опытная группа (тербинафин);
2) 5 кроликов (10 глаз) – группа сравнения (вориконазол);
3) 5 кроликов (10 глаз) – контрольная группа (без лечения).
Контроль микрофлоры производили культуральным и ицитологическим способом. Забор мазка для культурального исследования с конъюнктивы исследуемого глаза производили непосредственно перед заражением, далее при достижении язвы роговицы (у разных кроликов 12-14-й день от начала заражения), далее на 1-е, 2-е, 3-и сутки от начала лечения. Соскобы с роговицы для цитологического исследования забирались также при развитии язвы роговицы, далее – на 1-е, 2-е, 3-и сутки от начала лечения. Динамика культивирования на питательной среде отражена на рис. 8. (слева-направо): перед началом лечения: экспоненциальный рост воздушных хлопьевидно-войлочных колоний серовато-белого цвета; 2-й день: резкая убыль числа колоний; 3-й день: питательная среда стерильна, что коррелировало с клинической картиной кератомикоза.
При цитоскопии соскобов роговицы выявили убыль морфологических элементов грибов от начала лечения (рис.9).
Морфологическое исследование продемонстрировало резкую убыль морфологических элементов грибковых агентов (мицелия и конидий) с ранним началом противогрибковой терапии. Это сопровождается ингибированием воспалительного процесса и лизиса коллагена стромы роговицы (рис.10,11,12).
На 3-й день от начала инстилляций 0,1% суспензии тербинафина достигнуто купирование гипопиона, резорбция инфильтрата, регенерация язвы, сформировано легкое помутнение стромы роговицы (рис.13).
Бактериологическое и микологическое исследование мазка отделяемого конъюнктивы, забранного в этот день, роста не выявил. Цитоскопия соскоба с роговицы также живых грибковых элементов не обнаружила. Гистологическая картина показала явления субэпителиального легкого кератита без грибковых элементов в структуре роговицы (рис. 14).
Применение тербинафина позволило в 100% случаев санировать конъюнктивальную полость экспериментальных животных при грибковом кератите, что подтверждено клинико-лабораторными данными.
Экспериментальное сравнение эффективности 0,1% тербинафина и 1,0% вориконазола при грибковом кератите (2-я серия исследования).
Проведено проспективное экспериментальное исследование на кроликах породы «шиншилла», рандомно разделенных на 3 группы по 10 глаз. Лечение в I группе проводили инстилляциями вориконазола, разведенного для внутривенного введения в концентрации 1 мг/мл по 1 кап 4 раза в сутки [Thomas P.A., Leck A.K. et. al, 2005, Burton M.J., Pithuwa J. et. al, 2011, Thomas P.A., Kaliamurthy J. et. al, 2013, Prajna N.V., Krishnan T., et. al, 2016]. II группа получала инстилляции тербинафина 1 мг/мл (0,1%) по 1 кап 4 раза в сутки. III группа лечения не получала. Забор мазка для культурального исследования и соскоб с роговицы для цитоскопии производили до начала лечения, в 1-е, 3-и и 4-е сутки лечения. Лечение продолжали до клинического выздоровления и лабораторно подтвержденной санации. Оценку воспалительных изменений переднего отдела проводили в соответствии со шкалой [В. В. Нероев, Е. В. Яни, 2020].
Анализ динамики раздражения глаз в зависимости от исследуемой группы выявил существенные различия (рис. 15,16,17). Используемый метод: Хи-квадрат Пирсона. В ходе анализа в группе отсутствия лечения были выявлены статистически значимые изменения (p < 0,001). Используемый метод: критерий Фридмана.
Так же был проведен анализ динамики язвенного дефекта в зависимости от исследуемой группы (рис.18,19). В исследуемых группах установлены статистически значимые различия (p < 0,001).
Приведенные данные свидетельствуют о достоверном уменьшении диаметра язвенного дефекта (d) начиная с 1 суток в 1 и 2 группе. Используемый метод: Хи-квадрат Пирсона.
Анализ высева грибов из инфильтратов роговицы проводился соответственно на пике заражения, далее – на 1-е, 3-и, 4-е сутки и сгруппирован в зависимости от исследуемой группы (рис.20).
Полученные результаты позволили оценить эффективность лечения кератитов и язв роговицы, вызванных грибами рода Fusarium spp., включающего применение офтальмологической 0,1% суспензии тербинафина. Активность воспалительного процесса в роговице, выраженная в баллах, достоверно уменьшалась во всех группах в течение первых трех дней лечения. Исследование показало, 100% кроликов 1 группы и 100% кроликов 2 группы достигли клинического и лабораторного выздоровления на 4 день от начала эксперимента (p <0,05) (рис. 21,22,23).
В роговице кроликов, не получавших лечения, сохранялись признаки активного воспаления, в 40% приведшего к перфорации роговицы (рис.24), что, на наш взгляд, сопоставимо с клиническим течением агрессивного кератомикоза у пациентов, не получающих своевременно адекватного этиологического лечения (p <0,05).
Предложенный способ лечения, предусматривающий применение 0,1% суспензии тербинафина (1000 мкг/мл) в режиме инстилляций от 4 р/сут, при грибковом поражении роговицы, представляется эффективным. В случае отсутствия положительной динамики лечения, рекомендуется повторное культуральное исследование мазка с роговицы и конъюнктивальной полости с целью уточнения микрофлоры и ее чувствительности к антимикробным препаратам.
Выводы
1. Разработанные новые экспериментальные модели грибкового кератита и язвы, вызванные грибами рода Fusarium, 100% воспроизводимы, позволяют изучать особенности патогенеза язвенного процесса грибковой этиологии, оценивать результаты различных способов лечения в экспериментальных исследованиях. Модель кератомикоза этиологически оправдана, исходы в отсутствие лечения аналогичны осложнениям неадекватного и несвоевременного лечения грибкового кератита и язвы роговицы у человека.
2. Лабораторное исследование биодоступности показало, что на поверхности конъюнктивы после инстилляции 0,1% суспензии, тербинафин обнаруживался через 30 мин., во влаге передней камеры тербинафин в концентрации выше 0,01% не обнаружен. Однако это не исключает наличие тербинафина во влаге передней камеры в меньших концентрациях. 0,1% суспензия тербинафина имеет низкую проницаемость через ткани роговицы, но длительно сохраняется на глазной поверхности.
3. Экспериментальное исследование продемонстрировало, что применение 0,1% суспензии тербинафина при грибковом поражении роговицы, вызванным грибами рода Fusarium, обеспечило замещение язвенного дефекта высоко упорядоченной фиброзной тканью, что способствует формированию приближенной к нормальной структуры роговицы с формированием бессосудистых легких помутнений с мономорфным волокнистым строением фиброзной ткани.
4. Экспериментальные данные свидетельствуют о санации от чувствительной грибковой флоры на 4-й день при лечении с использованием 0,1% офтальмологической суспензии тербинафина. Регенерация язвенного дефекта в группе лечения тербинафином достигнута быстрее, чем в группе лечения 1,0% вориконазолом. В совокупности, эти факторы позволяют сократить сроки выздоровления, предотвращают риски перфорации и формирования грубых бельм роговицы.
5. Предложенный способ лечения грибкового кератита с применением офтальмологической суспензии тербинафина экспериментально и научно обоснован. Доказано, что способ является эффективным. Экспериментальные данные подтверждают безопасность местного применения 0,1% суспензии тербинафина, что позволяют рекомендовать ее изучение для лечения кератомикозов в клинических исследованиях.
Практические рекомендации
1. Новые экспериментальные модели грибкового кератита и кератоувеита, разработанные с учетом клинически значимой грибковой флоры, позволяют изучать и оценивать результаты различных способов лечения кератомикозов, что в перспективе даст возможность разрабатывать и выбирать оптимальные методы и алгоритмы лечения.
2. Доказанная эффективность этиологической терапии экспериментальных грибковых воспалений роговицы 0,1% суспензией тербинафина демонстрирует перспективность его применения при лечении кератомикозов в клинической практике.
3. Данные клинического, культурального и морфологического исследования, показавшие безопасность и эффективность действия офтальмологической 0,1% суспензии тербинафина, могут способствовать клиническим исследованиям данного препарата.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Давлетшина Н.И., Самойлов А. Н. Эпидемиология и методы лечения грибковых кератитов // Вестник офтальмологии. – 2020. – Т. 136, № 4. – С. 138–145. – DOI 10.17116/oftalma2020136041138.
2. Самойлов А. Н., Давлетшина Н.И. Анализ этиологии и антимикробной чувствительности возбудителей грибковых кератитов в серии клинических случаев // Офтальмохирургия. – 2020. – № 1. – С. 71–76. – DOI 10.25276/0235-4160-2020-1-71-76.
3. Тактика врача-офтальмолога : практическое руководство / Э.А. Абдулаева, С.Н. Булгар, Р.Ф, Гайнутднова, Н.И.Давлетшина [и др.] под ред. В. В. Нероева. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2020. - 296 с. : ил. - (Серия "Тактика врача"). - DOI: 10.33029/9704-5593-7-OPH-2020-1-296. - ISBN 978-5-9704-5593-7.
4. Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И. Современные проблемы лечения грибковых кератитов. Наш опыт консервативной терапии. Сборник тезисов по материалам республиканской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии». – 2021. С. 124.
5. Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И. Возможности и проблемы консервативной терапии грибковых кератитов в условиях стационара // Современные технологии в офтальмологии. – 2021. – № 4(39). – С. 36-40. https://doi.org/10.25276/2312-4911-2021-4-36-40
6. Абдулаева Э.А., Давлетшина Н.И., Идрисова К. Ф. Послеоперационные кератиты неясной этиологии при оперативном вмешательстве. Сборник тезисов по материалам республиканской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии». – 2022. С. 10.
7. Тактика ведения пациента в офтальмологии : практическое руководство / Э.А. Абдулаева, С.Н. Булгар, Н.И.Давлетшина [и др.] под ред. И. А. Лоскутова. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2023. - 208 с. : ил. - (Серия "Тактика врача"). - DOI: 10.33029/9704-7833-2-OFP-2023-1-208. - ISBN 978-5-9704-7833-2.
8. Давлетшина Н.И., Самойлов А.Н., Лисовская С.А., Анисимов А.Н., Айдова А.В. Экспериментальное изучение эффективности тербинафина в лечении грибковых кератитов // Вестник офтальмологии. – 2023. – Т. 139, № 4. – С.14 – 21 . https://doi.org/10.17116/oftalma202313904114.
9. Давлетшина Н.И., Самойлов А.Н. Экспериментальная модель грибкового кератоувеита с язвой роговицы, основанная на анализе этиологии клинических наблюдений грибкового кератита // Вестник НМХЦ им. Н.И. Пирогова. – 2023. – Т. 18, № 3. – С. 100-103. https://doi.org/10.25881/20728255_2023_18_3_100
В том числе Патенты РФ на изобретения по теме диссертации:
10. Патент РФ № 2746647 от 19.04.2021 г. «Способ создания экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов». Авторы Самойлов А.Н. Давлетшина Н.И., Шакирова Ф.В., Давлетшина И.И., Самойлова П.А.
11. Патент РФ № 2768476 от 24.03.2022 г. «Способ создания экспериментальной модели грибкового кератоувеита у кроликов». Авторы Самойлов А.Н. Давлетшина Н.И., Валиева Р.И., Лисовская С.А., Исаева Г.Ш., Шакирова Ф.В., Давлетшина И.И., Самойлова П.А.
12. Патент РФ № 2802388 от 28.08.2023 г. «Способ лечения грибковой язвы роговицы». Авторы Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И., Давлетшина И.И., Самойлова П.А., Исаева Г.Ш., Лисовская С.А.
Список сокращений
КНИИЭМ – Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
КОЕ – Колониеобразующая единица
МИК – Минимальная ингибирующая концентрация
МКЛ – Мягкая контактная линза
ОСТ – Оптическая когерентная томография
Trb – Тербинафин
