Общая характеристика работы
Актуальность темы
Ретинальная ишемия - частая причина снижения и потери зрения, развивающаяся на фоне сосудистых заболеваний (окклюзии ретинальных сосудов, диабетической ретинопатии, оптической нейропатии и т. д.) (Курышева Н. И. и соавт., 2012; Шеремет Н. Л. и соавт., 2012; Нероев В. В. и соавт., 2013; Sun C. et al, 2013). В связи с этим остаётся актуальным вопрос изучения ишемического поражения сетчатки в эксперименте у животных для более глубокого понимания патогенеза и выбора методов лечения данной патологии.
Известно, что транзиторные нарушения кровообращения глаза включают два периода: отсутствие кровотока (ишемия) и его восстановление (реперфузия), которые являются частью одного патологического процесса – ишемии-реперфузии. В период реперфузии образуются активные формы кислорода, высвобождаются воспалительные интерлейкины, что ведет к повреждению мембран клеток, миграции лейкоцитов в очаг воспаления с усилением повреждения тканей (Carden D. L., Grander D. N., 2000).
Для создания экспериментальной модели транзиторной ишемии сетчатки используют окклюзию церебральной артерии, лигирование сонных артерий, фотокоагуляцию ретинальных сосудов и введение эндотелина-1 (Гундорова Р. А. и соавт., 2008; Каламкаров Г. Р. и соавт., 2008; Steele E. C. et al, 2008; Ueda K. et al, 2010; Yuan Y-Z., 2010). В зарубежных публикациях представлено моделирование ишемического поражения, основанного на повышении внутриглазного давления (ВГД) выше уровня системного артериального давления (Joachim S. C., 2011; Suk-Yee Li et al, 2011; Zhang Z. et al, 2012, Liu X. Q. et al, 2013). До сих пор ведётся поиск наиболее адекватной экспериментальной модели ишемии-реперфузии глаза, отвечающей требованиям одновременно высокой экономичности, воспроизводимости и эффективности. Создание такой модели позволит исследовать гемодинамические, нейротрофические и структурные изменения в сетчатке в постишемическом периоде, что является необходимым для понимания патогенеза и определения новых направлений терапии ретинальной ишемии.
В настоящее время продолжается разработка и внедрение различных способов медикаментозной коррекции ишемического-реперфузионного повреждения глаза (Liu X. Q. et al, 2012; Tong N. et al, 2012; Vin A. P. et al., 2012; Chan C. M. et al, 2013; Huang W. et al., 2013).
Внимание клиницистов в последние годы привлекает ряд положительных эффектов антиоксиданта ресвератрола, который применяется в лечении сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, метаболических расстройств. В экспериментальных исследованиях за рубежом наряду с антиоксидантным действием продемонстрированы противовоспалительные и антиангиогенные свойства ресвератрола (Hua J. et al., 2011; Petrovski G. et al., 2011; Vang O. et al., 2011). Рядом авторов установлены нейропротекторные свойства ресвератрола на основании морфофункциональных методов исследования при моделировании ишемии-реперфузии сетчатки (Li C. et al., 2012; Liu X. Q. et al., 2012; Kim S. H. et al., 2013; Vin A. P. et al, 2013). Однако влияние этого антиоксиданта на регионарную гемоциркуляцию и нейротрофические факторы сетчатки специальному исследованию не подвергалось.
Цели и задачи исследования
Цель. Изучить особенности глазного кровотока, нейротрофические и морфологические изменения в тканях глаза и возможность их коррекции при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в эксперименте на крысах.
Задачи
1. Разработать в эксперименте на крысах модели регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
2. С помощью ультразвукового исследования сосудов орбиты в режиме трёхмерной реконструкции и энергетического картирования разработать в эксперименте 3D схему кровоснабжения глаза крысы.
3. Изучить особенности гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте на крысах в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза.
4. Исследовать динамику основных маркеров клеточного апоптоза, нейротрофических и воспалительных факторов в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
5. Изучить морфологические изменения в тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии в эксперименте на крысах.
6. Изучить влияние ресвератрола на гемодинамические, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза в эксперименте при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
Научная новизна исследования
В эксперименте на крысах созданы новые модели регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
Разработана 3D схема кровоснабжения глаза крысы на основании 3D реконструкции изображения сосудистых структур орбиты в режиме энергетического картирования.
Впервые с использованием комплекса инструментальных, лабораторных и морфологических исследований определены ишемически-реперфузионные изменения в тканях глаза у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза путем повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
Впервые изучены особенности глазного кровотока у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в тканях глаза в раннем и позднем постишемическом периоде.
Впервые в эксперименте на крысах определены маркёры апоптоза, нейротрофические и воспалительные факторы в норме и их изменения в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
Установлено положительное влияние ресвератрола на гемодинамику в сосудах глаза. На модели регионарной ишемии-реперфузии у крыс доказаны ретинопротекторные, нейропротекторные и противовоспалительные свойства ресвератрола при длительном его применении (от 1 до 2 месяцев).
Теоретическая и практическая значимость
1. Созданы экспериментальные модели регионарной ишемии-реперфузии глаза для изучения патогенеза и разработки методов лечения ишемической патологии сетчатки. Полученные модели являются простыми, легко воспроизводимыми и не требуют дорогостоящего оборудования.
2. На основании гемодинамических, лабораторных и патоморфологических исследований получены данные об особенностях течения раннего и позднего постишемического периода при регионарной ишемии-реперфузии глаза, которые позволят разработать в клинической практике более четкие алгоритмы ведения пациентов с сосудистой патологией глаза.
3. Экспериментальное обоснование эффективности длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола является основанием для последующего изучения его применения в клинической практике при ишемических поражениях глаза.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне экспериментального исследования с использованием инструментальных, морфологических и статистических методов
Основные положения, выносимые на защиту
1. Создание в эксперименте на крысах двух моделей регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.
2. Регистрация нарушений гемодинамики в орбитальных сосудах в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии глаза и возможность их коррекции ресвератролом.
3. Доказательство нейротрофических и воспалительных изменений в тканях глаза (активация системы проницаемости митохондриальных мембран, клеточного апоптоза и увеличение концентрации маркеров воспаления в комплексе сетчатка- хориоидея) в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.
4. Доказательство морфологических изменений в тканях переднего и заднего отрезка глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.
5. Установлено положительное влияние длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола на состояние глазного кровотока, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза при экспериментальной регионарной ишемии-реперфузии.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности и апробация результатов определяется репрезентативным объёмом выборки исследований, выполненных с использованием современных методов обследования и применением корректных методов статистической обработки.
Работа прошла апробацию на межотделенческой конференции ФГБУ МНИИ ГБ им. Гельмгольца Минздрава России. Основные материалы диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях: SIDUO XXV Конгресс (Германия, Берлин 2014); Международный офтальмологический конгресс «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2015); VII Российский общенациональный офтальмологический форум «РООФ 2015» (Москва, 2015); VII Съезд Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине (РАСУДМ) (Москва, 2015); II Европейский съезд молодых учёных (Испания, Овьедо, 2016).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 – в журналах, рецензируемых ВАК РФ и 2 патента РФ: патент на изобретение РФ №2577242 "Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки" от 11.02.2016 и патент на изобретение РФ №2577449 «Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки у крыс» от 15.02.2016.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 205 источников (66 отечественных и 139 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 24 рисунками. Работа выполнена в отделе ультразвуковых исследований (начальник д.м.н., профессор Киселёва Т. Н.), на базе научного экспериментального центра (заведующая к.б.н. Щипанова А. И.), отдела патологической анатомии и гистологии (начальник д.м.н., профессор Хорошилова-Маслова И. П.) и отдела иммунологии и вирусологии (начальник д.м.н., профессор Слепова О. С., совместно с к.б.н. Балацкой Н. В.) ФГБУ «МНИИГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Содержание работы
Материал и методы исследования
Исследование проведено на 110 крысах породы Wistar со средней массой 200 – 250 гр. Возраст животных составлял от 3 до 5 месяцев.
Все инвазивные вмешательства проводились при сочетании общей анестезии по стандартной схеме из расчета дозы вещества на массу тела, принятой в лабораторной практике для работы с крысами и местной анестезии 0,4% раствором оксибупрокаина (инокаин). Эксперимент состоял из трех этапов. Первый этап включал оценку состояния кровотока в орбитальных сосудах до начала приема антиоксиданта ресвератрола и через 30 суток после начала его применения. На втором этапе проводилось моделирование ишемии-реперфузии путём повышения ВГД до 110 мм.рт.ст. на 30 минут (патент РФ на изобретение №2577449 от 15.02.2016) и субконъюнктивального введения раствора ЭТ-1 в дозе 0,2 мл 4*10 -6 моль/л (М) (патент РФ на изобретение №2577242 от 11.02.2016). Третий этап включал оценку состояния переднего отрезка глаза, ультразвуковое исследование глаза и орбиты в B-режиме, оценку глазного кровотока, лабораторные и морфологические исследования биоматериала после эвтаназии животных.
Согласно задачам исследования на первом этапе все животные были разделены на две группы: в 1 группу вошли 50 интактных крыс (50 глаз), во 2 группу - 60 крыс (60 глаз), которые получали ресвератрол перорально в дозе 20 мг/кг с питьевой водой в течение 30 суток.
На втором этапе исследования все животные 1 группы были разделены на три подгруппы: 20 животных (20 глаз), которым моделирование ишемии-реперфузии проводилось путём повышения ВГД на одном глазу (1А подгруппа), 20 животных (20 глаз), у которых моделировали ишемию-реперфузию с помощью одностороннего субконъюнктивального введения эндотелина-1 (ЭТ-1) (1Б подгруппа) и 10 интактных крыс (20 глаз) составили контрольную (1В) подгруппу.
Животные 2-й группы, получавшие ежедневно ресвератрол, были разделены на две подгруппы. 2А подгруппу составили 30 крыс (30 глаз), которым осуществляли моделирование односторонней ишемии-реперфузии путём повышения ВГД. В 2Б подгруппу вошли 30 крыс (30 глаз), у которых моделирование ишемии-реперфузии проводилось с помощью одностороннего субконъюнктивального введения ЭТ-1. После моделирования регионарной ишемии-реперфузии животные 2 группы продолжали получать антиоксидант до момента эвтаназии. Всем животным автор самостоятельно выполнял осмотр с помощью бинокулярной лупы для оценки состояния переднего отрезка глаза и прямую офтальмоскопию для подтверждения появления ишемии сетчатки. Выраженность кератопатии и реакция переднего отрезка глаза оценивалась по шкале в условных баллах по 5 критериям (светобоязнь и блефароспазм, отёк роговицы, отёк радужки, кровь в передней камере, неоваскуляризация роговицы). Критериями исключения из эксперимента явились: отслойка сетчатки, эндофтальмит, гипопион и цилиохориоидальная отслойка, возникшие в постишемическом периоде.
Ультразвуковые методы исследования проводились на многофункциональной ультразвуковой диагностической системе Voluson E8 Expert (GE Healthcare) до начала приема ресвератрола, через 30 суток после начала перорального применения антиоксиданта, в первые минуты после моделирования ишемии-реперфузии и через 3, 7 и 30 суток.
Применение мультичастотного объемного линейного датчика RSP 6–16-D позволило определить основные орбитальные сосуды в режиме энергетического картирования (ЭК) с трехмерной реконструкцией изображения. Определение показателей гемодинамики осуществлялось с помощью ЭК и импульсной допплерографии. Регистрировали спектр допплеровского сдвига частот (СДСЧ) и основные количественные показатели кровотока: максимальную систолическую скорость (Vsyst), конечную диастолическую скорость (Vdiast) и индекс резистентности или периферического сопротивления (RI).
Перед оценкой гемодинамических параметров автором самостоятельно проводилось измерение системного артериального давления (АД) под общим наркозом с помощью системы неинвазивного измерения АД c хвостовой манжетой IITC (США) (Mouse Rat Blood Pressure System IITC Life Science Inc., USA).
Животных выводили из эксперимента под наркозом путём декапитации через 3, 7 и 30 суток после моделирования ишемии-реперфузии.
Лабораторные методы исследования. Данный раздел работы выполнен на базе отдела иммунологии и вирусологии Института (руководитель – д.б.н., профессор Слепова О. С.) совместно с к.б.н. Балацкой Н. В. Материалом для исследований послужили сыворотка крови (СК) и гомогенаты тканей комплекса сетчатка-хориоидея крыс. Определяли следующие показатели: факторы митохондриального (BAX/BCL-2) и внешнего пути апоптоза (sFas/FasL), показатель повреждения нервной ткани - глиофибриллярный кислый протеин (GFAP), маркёр воспаления (МСР-1), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и фактор роста нервов (NGF).
Методы гистологического исследования. Патогистологическое исследование проводилось на базе отдела патологической гистологии и анатомии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (руководитель отдела д.м.н., профессор Хорошилова-Маслова И. П.). Энуклеацию глазного яблока у крыс производили через 3, 7 и 30 суток после ишемии-реперфузии. Энуклеированные глаза фиксировали в растворе Боуэна. После макроскопического исследования вырезали колодку глазного яблока, которую обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 0,5-1,5 мкм готовили на микротоме Leicа RM2235 (Германия) и окрашивали гематоксилин-эозином. Препараты исследовали и фотографировали с помощью светового микроскопа на микросистеме Leicа (Германия) при увеличении ×40, ×100, ×200, ×400.
Статистический анализ выполнен автором самостоятельно с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и “Statistica 6.0” (Stat. Soft. Inc, США). Для оценки статистической значимости применяли t-критерий Стьюдента и тест Манна-Уитни. Разница считалась достоверной при p<0,05.
Результаты собственных исследований
Рис. 1. Динамика факторов апоптоза в тканевом комплексе сетчатка-хориоидея при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза.а) BAX и BCL-2 при повышении ВГД (1А подгруппа), б) BAX и BCL-2 при введении ЭТ-1 (1Б подгруппа), в) sFas и FasL при повышении ВГД (1А подгруппа), г) sFas и FasL при введении ЭТ-1(1Б подгруппа)
Рис. 2. Динамика факторов апоптоза в тканевом комплексе сетчатка-хориоидея при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза у животных, получавших ресвератрол. а) BCL-2 при повышении ВГД (2А подгруппа), б) BCL-2 при введении ЭТ-1(2Б подгруппа)
Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до моделирования ишемии-реперфузии. Соотношение результатов исследования в серой шкале с объемной цветовой картой потоков крови в режиме ЭК с трехмерной реконструкцией изображения позволило правильно оценить прижизненную пространственную топографию хода сосудов в орбите. Для точного определения глазных артерий сравнивали место визуализации потока крови с проекцией зрительного нерва. Если поток крови располагался кнутри от зрительного нерва, то его определяли как верхнюю глазную артерию (ВГА), если кнаружи – как нижнюю глазную артерию (НГА). В аксиальной плоскости сканирования идентифицировали задние длинные цилиарные артерии (ЗКЦА), если сосудистая структура визуализировалась вблизи заднего полюса глаза и параллельно ему, при этом поток крови был направлен в сторону глаза. При проведении аксиальной плоскости сканирования через задний полюс глаза в проекции зрительного нерва определяли центральную артерию сетчатки (ЦАС).
В результате выполненного анализа трехмерной реконструкции сосудистой системы глаза и орбиты крысы с учетом литературных данных разработана 3D схема кровоснабжения глаза крысы. В отличие от представленной ранее схемы 2D показано, что задняя цилиарная артерия (ветвь нижней глазной артерии) первоначально в орбите отдает ЦАС, затем у заднего полюса глаза - две ЗДЦА. Предложенная схема имеет существенное значение для точной регистрации показателей гемодинамики в сосудах глаза.
Рис. 3. Динамика глиального кислого фибриллярного белка (GFAP) в сыворотке крови при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза у животных, получавших ресвератрол. а) при повышении ВГД (2А подгруппа), б) при введении ЭТ-1 (2Б подгруппа).
Рис. 4. Динамика изменения концентрации моноцитарного хемоаттрактантного протеина (MCP-1) в тканевом комплексе сетчатка-хориоидея при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза у животных, получавших ресвератрол. а) при повышении ВГД (2А подгруппа), б) при введении ЭТ-1 (2Б подгруппа).
Таким образом, через 30 суток после начала перорального применения антиоксиданта ресвератрола наблюдалось увеличение скорости кровотока (Vsyst и Vdiast) и снижение индекса периферического сопротивления во всех исследуемых артериях, что свидетельствовало об улучшении гемоперфузии глаза.
Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах при моделировании ишемии-реперфузии. Средний уровень системного АД в хвостовой артерии у животных 1А и 2А подгрупп до проведения ультразвукового исследования во все сроки достоверно не отличался от показателей в подгруппе контроля (p>0,05) (табл. 2). Исследование гемодинамики в сосудах глаза показало снижение показателей скорости кровотока (Vsyst и Vdiast) в ЦАС и ЗДЦА через 3 суток после ишемии в обеих подгруппах. В позднем постишемическом периоде (через 30 суток) имело место выраженное снижение Vsyst в ЦАС на 33,7%, в ЗДЦА на 36,2% по сравнению с контролем (p<0,05) (табл. 2). Однако показатели кровотока в НГА и ВГА в 1А подгруппе достоверно не отличались от таковых в контрольной 1В подгруппе, что может свидетельствовать о преимущественном нарушении кровотока в сосудах малого калибра (ЦАС, ЗДЦА) при моделировании ишемии-реперфузии путем повышения ВГД.
У крыс 1Б подгруппы, где моделирование ишемии-реперфузии осуществляли с помощью субконъюнктивального введения ЭТ-1, выявлено статистически достоверное снижение показателей скорости кровотока в ЦАС, ЗДЦА, НГА в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) в среднем на 37,03%, 26,85% и 14,52% соответственно (p<0,001) и увеличение RI в этих сосудах по сравнению с контрольной подгруппой (p<0,001). Через 7 суток у этих животных регистрировали статистически достоверное повышение Vsyst (p<0,05) и RI (p<0,001) в ЦАС (табл. 3), в ЗДЦА, НГА и ВГА (p<0,001) по сравнению с таковыми показателями в подгруппе контроля, что свидетельствовало об отсроченной гиперперфузии глаза в этот период наблюдения. В отдалённом постишемическом периоде (через 30 суток) отмечали достоверное снижение Vsyst в ЦАС в среднем на 57,41%, в ЗДЦА на 30,11%, на 42,9% в НГА и 21,7% в ВГА по сравнению с подгруппой контроля (p<0,05) (табл. 3).
Таблица №1 Оценка повреждения переднего отрезка глаза у крыс после моделирования ишемии-реперфузии (суммарное число баллов).
Таблица №2 Средние параметры глазного кровотока у крыс после ишемии-реперфузии путём повышения ВГД (M±m)
Результаты лабораторных методов исследования тканей глаза и сыворотки крови в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии. Анализ результатов исследования в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) показал повышение маркёров апоптоза, в частности, белков-регуляторов проницаемости митохондриальной мембраны BAX/BCL-2 (рис. 1а, б), достоверное снижение концентрации нейротрофического фактора (фактора роста нервов NGF) (p<0,001), вероятно, из-за ослабления его продукции или активного потребления, и повышение концентрации хемоаттрактантного протеина MCP-1 (маркера воспаления) в тканях глаза. Через 7 суток после ишемии регистрировали усиление активности факторов BAX/BCL-2 внутриклеточной и внешней sFas/FasL рецепторной систем апоптоза, наиболее выраженное у животных с ишемией-реперфузией, индуцированной введением ЭТ-1 (рис. 1в, г). В этот период наблюдали максимальную концентрацию маркёра повреждения нервной ткани (GFAP) в сыворотке крови, что могло свидетельствовать о нарушении проницаемости гематоофтальмического барьера, а повышение концентрации MCP-1 - об усилении воспалительной реакции в комплексе сетчатка-хориоидея. Достоверное повышение концентрации нейротрофического фактора мозга BDNF и фактора роста нервов NGF указывало на активацию защитных нейропротекторных механизмов в тканях глаза в ответ на повреждающий фактор ишемии-реперфузии. В позднем постишемическом периоде (через 30 суток) отмечалось увеличение концентрации маркёров внешнего и внутреннего апоптоза BAX/BCL-2 и sFas/FasL (Рис. 1в, г), маркёра воспалительной реакции MCP-1, нейротрофических факторов BDNF и NGF в комплексе сетчатка-хориоидея и GFAP в сыворотке крови у крыс в 1А и 1Б подгруппах. Лабораторные тесты показали наличие выраженного апоптоза, воспалительных и нейротрофических изменений в тканях глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при двух способах моделирования ишемии-реперфузии.
Применение ресвератрола в суточной дозе 20 мг/кг в течение длительного времени (1-2 месяца) в подгруппе 2А способствовало статистически достоверному увеличению уровня NGF в комплексе сетчатка-хориоидея в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) (p<0,001), снижению показателей маркёров апоптоза (sFas/Apo-1//sFasL) на 76,5% и 72,3% соответственно (p<0,001), BCL-2 на 74% по сравнению с подгруппой 1А (p<0,05) (рис. 2а), снижению уровня маркёра воспаления МСР-1 (p<0,001) и концентрации GFAP (p<0,001) в сыворотке крови в позднем постишемическом периоде (через 30 суток).
У крыс 2Б подгруппы применение антиоксиданта способствовало снижению уровня BCL-2 через 3 суток (p<0,001) и BAX на 75,6% (p<0,001) в тканях глаза через 30 суток (рис. 2б). В течение всего периода наблюдения отмечали статистически достоверное снижение концентрации маркёра воспаления MCP-1 (рис. 4а, б) и фактора повреждения нервной ткани GFAP у животных 2Б подгруппы по сравнению с 1Б подгруппой (p<0,05) (рис. 3а, б). Результаты лабораторных методов исследования сыворотки крови и тканей глаза показали снижение факторов апоптоза, воспалительных и нейротрофических изменений в комплексе сетчатка-хориоидея у животных 1Б и 2Б подгрупп, получавших ежедневно ресвератрол в течение длительного времени. При двух способах моделирования ишемии-реперфузии в эксперименте были установлены ретинопротекторные, нейропротекторные и противовоспалительные свойства ресвератрола в раннем и позднем постишемическом периоде.
Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии Выявлены ишемические изменения тканей переднего отрезка глаза (отёк и инфильтрация роговицы и радужки лимфоцитами), отек сетчатки и апоптоз ганглиозных клеток в раннем постишемическом периоде и уменьшение числа рядов обоих ядерных слоёв сетчатки с атрофией фоторецепторного слоя в позднем постишемическом периоде, что указывает на воспроизводимость представленных способов моделирования регионарной ишемии-реперфузии и возможность их применения для дальнейшего изучения патогенеза ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки и оценки эффективности способов его коррекции.
Уменьшение апоптоза ганглиозных клеток, атрофии фоторецепторного слоя и сохранение клеток ядерных слоёв на фоне длительного приёма ресвератрола (1-2 месяца) в суточной дозе 20 мг/кг подтверждает его ретино- и нейропротекторные свойства.
Выводы
1. В эксперименте на крысах разработаны две модели регионарной ишемии-реперфузии глаза: путем повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.2. Разработана прижизненная 3D схема кровоснабжения глаза крысы, которая показывает, что задняя цилиарная артерия (ветвь нижней глазной артерии) первоначально в орбите отдает центральную артерию сетчатки, затем у заднего полюса глаза - две задние длинные цилиарные артерии. Предложенная схема имеет существенное значение для точной регистрации показателей гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте.
3. С помощью ультразвуковых допплеровских методов установлено стойкое снижение кровотока в центральной артерии сетчатки и задних длинных цилиарных артериях в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и ухудшение гемодинамики во всех орбитальных артериях при моделировании с помощью субконъюнктивального введения эндотелина-1.
4. Особенностью модели регионарной ишемии-реперфузии с введением эндотелина-1 является усиление скорости кровотока (гиперперфузия) во всех исследуемых артериях через 7 суток, что свидетельствует о снижении сосудосуживающего эффекта вазоконстриктора в этот период.
5. В эксперименте установлены лабораторные маркёры ишемического повреждения тканей глаза в раннем постишемическом периоде: увеличение факторов апоптоза BAX и BCL-2, повышение концентрации моноцитарного хемоаттрактантного протеина (MCP-1) в комплексе сетчатка-хориоидея, свидетельствующие о выраженной активации клеточного апоптоза и воспалительной реакции в оболочках глаза.
6. Увеличение концентрации маркеров внешнего пути апоптоза sFas/FasL, МСР-1, нейротрофического фактора BDNF и фактора роста нервов NGF в тканях комплекса сетчатка-хориоидея через 7 суток после ишемии указывает на усиление процессов апоптоза и воспалительной реакции одновременно с активацией защитных нейропротекторных механизмов в этот период. Установлены максимальные уровни факторов апоптоза (BAX/BCL-2, sFas/FasL), маркеров воспаления (MCP-1) и нейродегенерации (GFAP) в позднем постишемическом периоде.
7. На основании данных патоморфологических исследований установлены признаки ретинальной ишемии в виде отёка сетчатки и апоптоза ганглиозных клеток в раннем постишемическом периоде. В позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии путём повышения ВГД наблюдается преимущественная атрофия наружного фоторецепторного слоя сетчатки, связанная с нарушением хориоидального кровообращения в задних длинных цилиарных артериях, а при моделировании путём введения эндотелина-1 – полное разрушение нейрональных элементов, что согласуется с нарушением кровообращения во всех артериальных сосудах глаза.
8. В эксперименте установлены ретинопротекторные, нейропротекторные, антиангиогенные и противовоспалительные свойства ресвератрола на основании уменьшения степени неоваскуляризации роговицы, улучшения состояния гемодинамики глаза, снижения концентрации факторов клеточного апоптоза и маркеров воспаления в тканях глаза и уменьшения уровня факторов повреждения нервной ткани в сыворотке крови при регионарной ишемии-реперфузии.
Практические рекомендации
1. Разработанные способы моделирования ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и с помощью субконъюнктивального введения 0,2 мл 4*10 -6 М раствора эндотелина-1 могут быть использованы для оценки эффективности и выбора способов лечения ишемии сетчатки в эксперименте.2. Разработанная 3D схема кровоснабжения глаза крысы с помощью трехмерной ультразвуковой реконструкции сосудов орбиты в режиме энергетического картирования представляет дополнительные данные о прижизненной анатомической структуре, топографии васкуляризации глаза и орбиты и расширяет возможности ультразвуковых исследований при моделировании офтальмопатологии в эксперименте.
3. Экспериментальное обоснование ретинопротекторных, нейропротекторных, антиангиогенных и противовоспалительных свойств антиоксиданта ресвератрола является основанием для последующего его применения в клинической практике в комплексном лечении сосудистых и нейродегенеративных заболеваний сетчатки.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Киселёва, Т. Н. Экспериментальное моделирование ишемического поражения глаза / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин // Вестник РАМН. - 2014. -№11-12. - С. 97-103.2. Киселёва, Т. Н. Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, К. А. Рамазанова // Вестник офтальмологии. - 2014. -Т. 130, №5. - С. 100-103.
3. Киселёва, Т. Н. Влияние ресвератрола на микроциркуляцию и структурные изменения глаза при моделировании ишемии-реперфузии сетчатки в эксперименте / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, А. И. Щипанова, И. П. Хорошилова-Маслова // Российский офтальмологический журнал. - 2016. – Т. 9, №3. - С. 50-56.
4. Нероев, В. В. Допплеровские методы в оценке влияния антиоксидантов на гемодинамику глаза в эксперименте / В. В. Нероев, Т. Н. Киселева, А. В. Чудин, Щипанова А.И. // Ультразвуковая и функциональная диагностика. – 2015. –№5. Часть II. – С. 121.
5. Нероев, В. В. Влияние антиоксиданта растительного происхождения (ресвератрола) на глазной кровоток в эксперименте / В. В. Нероев, Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, А. И. Щипанова, К. А. Рамазанова// Вестник офтальмологии. - 2016. – Т. 132, №2. - С. 55-61.
6. Kiseleva, T. N. Ultrasound methods of ocular blood flow in experiments on rats / T. N. Kiseleva, A.V. Chudin, K. A. Ramazanova, M. V. Ryabina, O. V. Zolotych, V. V. Neroev // Final Programme and abstract booklet SIDUO XXV Congress. - Berlin, 2014. – P. 89.
Изобретения по теме диссертации
7. Пат. 2577242 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01) Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки крыс / Нероев В. В., Киселёва Т. Н., Чудин А. В., Безнос О. В., Хорошилова И. П., Щипанова А. И., Слепова О. С. , Балацкая Н. В; заявитель и патентообладатель ФГБУ "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения РФ. – № 2015114834/14; заявл. 21.04.15; опубл. 10.03.2016, Бюл. № 7. – 2 с.
8. Пат. 2577449 Российская Федерация, МПК А61F 9/00 (2006.01) Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки крыс / Киселёва Т. Н., Чудин А. В., Хорошилова И. П., Щипанова А. И., Слепова О. С. , Балацкая Н. В; заявитель и патентообладатель ФГБУ "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения РФ. – № 2015114835/14; заявл. 21.04.15; опубл. 20.03.2016, Бюл. № 8. – 2 с.
Список сокращений
ВГА – верхняя глазная артерияВГД–внутриглазное давление
ЗДЦА – задние длинные цилиарные артерии
ЗЦВ – задняя цилиарная вена
НГА – нижняя глазная артерия
СК – сыворотка крови
ТК – комплекс тканей сетчатка-хориоидея
ЦАС – центральная артерия сетчатки
ЦВС–цилиарная вена сетчатки
ЭТ-1– эндотелин-1
BAX– белок, вызывающий апоптоз за счет активации системы проницаемости митохондриальных мембран.
BCL-2– внутриклеточный белковый фактор, негативный регулятор апоптоза.
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга.
sFAS–растворимая форма рецептора внешнего пути апоптоза.
FasL–растворимый лиганд внешнего пути апоптоза.
GFAP (glial fibrillary acidic protein) – глиальный кислый фибриллярный белок.
MCP– 1– моноцитарный хемоаттрактантный протеин.
NGF (nerve growth factor) - фактор роста нервов.
