Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научные руководители:
Саакян Светлана Ваговна – доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАН;
Складнев Дмитрий Анатольевич – доктор биологических наук, профессор.
Официальные оппоненты:
Гришина Елена Евгеньевна – доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник онкологического отделения хирургических методов лечения, профессор кафедры офтальмологии и оптометрии ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского»;
Бонарцев Антон Павлович – доктор биологических наук, доцент кафедры биоинженерии биологического факультета «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».
Общая характеристика работы
Актуальность темы и степень ее разработанности
Опухоли придаточного аппарата глаза по распространенности среди новообразований органа зрения занимают лидирующее место (Бровкина А.Ф., 2002, Саакян С.В., 2015). Большое разнообразие их клинической картины становится причиной возникновения трудностей в определении доброкачественности или злокачественности новообразований (Shields J.A., 2015). Помимо этого, злокачественная опухоль придаточного аппарата глаза, особенно на ранних стадиях развития, нередко может симулировать доброкачественную опухоль (Niinimaki P., 2021, Shields J.A., 2015). В настоящее время единственным методом подтверждения доброкачественности или злокачественности новообразования является гистологическое исследование уже удаленной опухоли (Forman D., 2019). Однако взятие биоптата из опухоли до ее полного удаления из кожи век и конъюнктивы опасно, в некоторых случаях даже недопустимо, так как может привести к прогрессированию заболевания, ускорить течение опухолевого процесса и вызвать метастазирование (Енгибарян М.А., 2013). Установление ошибочного диагноза влечет за собой выбор неправильной тактики ведения пациента, повышает вероятность рецидива злокачественной опухоли, при возникновении которой увеличивается риск метастазирования, снижается качество жизни пациента и ухудшается витальный прогноз (Бородин Ю.И., 2009, Саакян С.В., 2019, Гришина Н.И., 2021). Своевременное выявление злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза имеет решающее значение для снижения инвалидизации больных и улучшения витального прогноза.
Поэтому актуальным остается вопрос о расширении арсенала диагностических методов, которые бы позволили до или во время хирургического вмешательства выявлять злокачественные опухоли даже на начальных стадиях их формирования.
Известно, что опухоли помимо морфологических особенностей, обладают отличительной чертой в виде генетически запрограммированного высокого уровня метаболизма, которое необходимо для поддержания жизнедеятельности, в том числе для пролиферации опухолевой клетки (DeBerardinis R.J., 2016, Hanahan D., 2012).
Несмотря на большое количество исследований по изучению энергетического метаболизма опухолей организма за последние двадцать лет, на данный момент точно установлено лишь то, что их метаболический профиль отличается друг от друга (Pandey N., 2020), остается открытым вопрос о метаболических особенностях разных опухолей.
Исследователями из ФИЦ Биотехнологии РАН продемонстрировано наличие четкой корреляции между формированием биогенных наночастиц серебра de novo и уровнем метаболизма изучаемых клеток на микробных моделях (Skladnev D.A., 2017, Sorokin V.V., 2020), который возможен благодаря фундаментальной естественной способности метаболизирующих клеток восстанавливать катионы серебра за счет наличия в своей структуре метаболически активных веществ, выступающих в роли доноров электронов (Patil. S., 2020).
Ранее работы по диагностике опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра de novo не проводились.
Цель исследования
Разработка метода диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра.
Задачи исследования
1. Провести клинико-морфологический анализ опухолей придаточного аппарата глаза.
2. Создать метод экспресс-диагностики опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра.
3. Провести оптимизацию основных параметров, влияющих на реакцию восстановления катионов серебра при участии здоровых и опухолевых тканей.
4. Оценить уровень восстановительной способности здоровых тканей придаточного аппарата глаза с помощью разработанного метода.
5. Оценить уровень восстановительной способности доброкачественных и злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза с помощью разработанного метода.
6. Провести сравнительную оценку восстановительной способности разных морфологических типов опухолей придаточного аппарата
Научная новизна
1. Впервые разработан метод экспресс-диагностики опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра.
2. Впервые определены концентрация источника катионов серебра и длительность реакции восстановления для формирования наночастиц серебра в присутствии здоровых тканей и опухолей придаточного аппарата глаза.
3. Впервые выявлена возможность здоровых и опухолевых тканей выступать в роли биологического восстановителя катионов серебра с формированием биогенных наночастиц.
4. Впервые представлены показатели уровня восстановительной способности здоровых тканей придаточного аппарата глаза в отношении катионов серебра, для здоровых тканей век она составила 0,056±0,006, конъюнктивы – 0,054±0,005.
5. Впервые представлены показатели уровня восстановительной способности опухолей придаточного аппарата глаза, где доброкачественные опухоли до 2,6 раз активнее восстанавливали катионы серебра, чем здоровые ткани из того же глаза, злокачественные опухоли – до 8,1 раз.
6. Впервые выявлено, что восстановительная способность злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза в среднем от 1,7 до 4,1 раз выше восстановительной способности доброкачественных опухолей придаточного аппарата глаза.
7. Впервые установлено, что восстановительная способность доброкачественных опухолей придаточного аппарата глаза значимо не различается по гистогенезу.
8. Впервые установлено, что разные типы злокачественных эпителиальных опухолей век (базальнокеточный рак, плоскоклеточный рак, аденокарцинома сальной железы) не проявляют значимые отличия в восстановительной способности.
9. Впервые установлено, что среди злокачественных эпителиальных опухолей конъюнктивы при оптимальных параметрах реакции наибольшей восстановительной способностью обладает плоскоклеточный рак.
10. Впервые установлено, что меланоцитарные опухоли обладают наибольшей восстановительной способностью среди злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза. Установлено, что они в среднем в 6,1 раз активнее восстанавливают катионы серебра по сравнению со здоровыми тканями, и в среднем в 2,4 раза активнее, чем злокачественные эпителиальные опухоли.
Практическая значимость
1. Разработан метод экспресс-диагностики опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра, который позволяет в пределах 20 минут определять доброкачественность или злокачественность новообразований придаточного аппарата глаза.
2. Установлены оптимальные значения основных параметров метода, влияющих на формирование наночастиц серебра в присутствии опухолей придаточного аппарата глаза.
3. Разработанный метод диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза позволяет определить объем хирургического вмешательства и оптимизировать тактику лечения.
4. Необходимо включить разработанный метод в алгоритм обследования больных для определения доброкачественности или злокачественности опухолей придаточного аппарата глаза при сложных дифференциально-диагностических случаях.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Выполнение работы проводили с использованием комплекса клинических, инструментальных, лабораторных методов в дизайне сравнительного исследования. Использование современных методов математико-статистического анализа позволило сформулировать выводы и практические рекомендации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Многообразие клинической картины опухолей придаточного аппарата глаза затрудняет определение доброкачественности или злокачественности новообразований.
2. Метод диагностики опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра позволяет определить восстановительную способность здоровых тканей и опухолей придаточного аппарата глаза в пределах 20 минут.
3. Уровень восстановительной способности опухолей придаточного аппарата глаза выше уровня восстановительной способности здоровых тканей.
4. Злокачественные опухоли придаточного аппарата глаза активнее восстанавливают катионы серебра по сравнению с доброкачественными опухолями.
5. Восстановительная способность различных типов злокачественных новообразований придаточного аппарата глаза отличается у опухолей различного гистогенеза.
Степень достоверности и апробация результатов. Достаточный и репрезентативный объём выборки, использование современных методов инструментального обследования, применение при создании метода сертифицированных приборов и стандартного источника катионов серебра, применение корректных методов статистической обработки определяют степень достоверности результатов проведенных исследований. Степень обоснованности результатов исследования подтверждается их новизной и практической значимостью.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследований внедрены в практику отделения офтальмоонкологии и радиологии ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России и используются при установлении доброкачественности и злокачественности опухоли придаточного аппарата глаза. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: научно-практическая конференция с международным участием «XIV Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2021), Четвертый международный форум онкологии и радиотерапии (Москва, 2021), VIII Ежегодная научная конференция Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва, 2021), Аспирантская сессия Форума университетской науки МГМСУ (Москва, 2022), секция молодых ученых на научно-практической конференции с международным участием «XV Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2022), X Юбилейный международный междисциплинарный конгресс по заболеваниям органов головы и шеи (Москва, 2022), Федоровские чтения (Москва, 2022), VI Международный форум онкологии и радиотерапии «For Life – Для жизни» (Москва, 2023), на международной конференции 11th Ocular Oncology Day (Сиена, 2023).
Апробация диссертации состоялась 20 сентября 2023 года на заседании межотделенческой конференции ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 – в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, получен 1 патент РФ на изобретение № 2776647 от 22.07.2022 г.
Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 139 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 5 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 271 источник, из них 54 российских и 217 иностранных авторов.
Содержание работы
Материал и методы исследования
Диссертационная работа выполнена в период с 2020 по 2023 год на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца» Минздрава России (директор – академик РАН, д.м.н., профессор В.В. Нероев). Разработка метода проведена совместно с д.м.н., профессором, членкорреспондентом РАН С.В. Саакян (ФГБУ «НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, директор – академик РАН, д.м.н., профессор В.В. Нероев) и д.б.н., профессором Складневым Д.А. (лаборатория выживаемости микроорганизмов института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, директор – д.б.н. Федоров Алексей Николаевич).
Настоящая работа основана на анализе результатов обследования больных отдела офтальмоонкологии и радиологии ФГБУ «НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца» (начальник – член-корреспондент РАН, д.м.н. профессор Саакян С.В.) с опухолями придаточного аппарата глаза и на оценке восстановительной способности опухолей придаточного аппарата глаза в отношении катионов серебра путем спектрометрической регистрации оптических свойств наночастиц серебра, сформированных в присутствии этих опухолей.
Все исследования одобрены локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» МЗ РФ (протокол № 54 от 13.05.21).
Общая характеристика клинического материала. Всего исследовано 187 больных с клинически установленным и гистологически подтвержденным диагнозом доброкачественной или злокачественной опухоли века и конъюнктивы. Возраст больных на момент поступления в стационар варьировал от 7 до 90 лет, средний возраст составил 53,7±19,1 лет. Распределение по полу: женщины – 105 (56,1%), мужчины – 82 (43,9%). Все пациенты разделены на две группы в зависимости от локализации патологического процесса: 1 группа – пациенты с опухолями век в количестве 86 человек (86 глаз), 2 группа – пациенты с опухолями конъюнктивы в количестве 101 человек (101 глаз).
Методы обследования пациентов. Всем пациентам проводили комплексное клинико-инструментальное обследование. Все пациенты подписали информированное добровольное согласие. На первом этапе клиническое обследование пациентов включало выяснение жалоб, где особое внимание обращали на изменение цвета, размера опухоли, наличие боли, зуда. При сборе анамнеза уточняли возраст возникновения первых признаков заболевания, возраст появления активных жалоб пациента, срок первого обращения к врачу, наличие факторов, предшествующих заболеванию и ранее проводимое лечение. Стандартное офтальмологическое обследование включало визометрию, авторефрактометрию, пневмотонометрию, внешний осмотр и пальпацию, биомикроскопию, гониоскопию, офтальмоскопию и фоторегистрацию переднего отдела глаза. Все исследования выполнены автором самостоятельно.
Спектрометрическое исследование. В условиях операционной отдела офтальмоонкологии и радиологии (заведующий операционным блоком №2 – к.м.н. Тацков Р.А.) у пациентов проводили биопсию из опухоли, удаленной радиохирургическим путем, и из здоровой ткани из того же глаза для контроля.
Размеры биоптата из опухоли и здоровой ткани были соотносимы. Удаленные ткани помещали в стерильные пластмассовые пробирки объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» для транспортировки в клинико-диагностическую лабораторию отдела биохимии и патофизиологии (и.о. начальника отдела – к.м.н. Павленко Т.А.), где проводили дальнейшие исследования с использованием следующих приборов и реактивов: • каждый биоптат взвешивали на электронных аналитических весах CPA225D (Sartorius, Германия) для уточнения массы;
• для проведения реакции восстановления использовали стандартный источник катионов серебра – раствор аммиаката серебра Ag(NH3)2NO3;
• инкубацию исследуемых тканей с Ag(NH3)2NO3 для формирования наночастиц серебра проводили при температуре 37оС в термостатируемом шейкере ST-3 (Elmi, Латвия) до 30 минут;
• удаление клеток биоптатов из реакционных смесей с наночастицами серебра проводили в лабораторной центрифуге LMC 4200-R (BioSan, Латвия) при 5000 об/мин в течение 5 минут;
• оптические свойства реакционных смесей с биогенными наночастицами серебра, сформированными de novo в присутствии клеток опухолевых или здоровых тканей век и конъюнктивы, определяли на многофункциональном фотометре Synergy MX (Bio-Tek, США).
В 1 группе проводили спектрометрическое исследование оптических свойств наночастиц серебра, сформированных в присутствии 86 биоптатов из опухолей век и 86 здоровых тканей из неизмененной кожи век того же глаза. Во 2 группе проводили спектрометрическое исследование оптических свойств наночастиц серебра, сформированных в присутствии 101 биоптата из опухолей конъюнктивы и 101 здоровых тканей конъюнктивы того же глаза.
Постановку реакции восстановления катионов серебра начинали с добавления в пробирки с исследуемыми тканями 500 мкл стандартного источника катионов серебра – раствора Ag(NH3)2NO3 в разных концентрациях (1000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 63 мкг/мл, 31 мкг/мл, 16 мкг/мл), получаемых при последовательном разведении дистиллированной водой. Реакционную смесь инкубировали в термостатируемом шейкере при температуре 37оС и 50 оборотах в минуту до 30 минут, отбирая пробы реакционной смеси с наночастицами серебра на 5, 10, 20 и 30 минуте. Отобранную реакционную смесь объемом 120 мкл переносили в новые пробирки и центрифугировали в течение 5 минут при 5000 оборотах в минуту.
После центрифугирования 100 мкл реакционной смеси с наночастицами серебра переносили в лунки микропланшета (рисунок 1) для определения оптических свойств наночастиц серебра на многофункциональном фотометре при фиксированных длинах волн (λ=395 нм, λ=400 нм, λ=405 нм, λ=410 нм, λ=415 нм, λ=420 нм) в специфическом диапазоне для наночастиц серебра. Полученные результаты исследования автоматически сохранялись в виде таблицы Excel на компьютере с программной установкой Windows.
Результаты спектрометрического определения уровня формирования биогенных наночастиц серебра (восстановительной способности опухолей век и конъюнктивы) представляли как соотношение показателя оптической плотности реакционных смесей с биогенными наночастицами серебра, сформированными в присутствии опухолей (Аt) к показателю оптической плотности реакционных смесей с биогенными наночастицами серебра, сформированными в присутствии контрольных здоровых тканей (An) с учетом оптической плотности раствора Ag(NH3)2NO3 (As) и выражали как коэффициент (Аk): Аk=(Аt - As)/(An - As).
В ходе разработки метода диагностики опухолей придаточного аппарата глаза на основе биогенного синтеза наночастиц серебра мы определили: концентрацию стандартного источника катионов серебра Ag(NH3)2NO3, достаточной для обеспечения формирования de novo биогенных наночастиц серебра при участии опухолевых и здоровых тканей век и конъюнктивы; оптимальное время инкубации опухолевых и здоровых тканей век и конъюнктивы c раствором Ag(NH3)2NO3, при котором будут регистрироваться наиболее показательные значения оптической плотности реакционной смеси с наночастицами серебра, сформированными de novo в присутствии опухолевых и здоровых тканей век и конъюнктивы; длину волны, при которой интенсивность поглощения реакционной смеси с наночастицами серебра, сформированными в присутствии опухолевых и здоровых тканей век и конъюнктивы, достигает максимальных значений.
Патоморфологическое исследование для подтверждения диагноза всем пациентам проведено на базе отдела патологической анатомии и гистологии (начальник отдела – к.м.н. Измайлова Н.С.).
Статистическая обработка выполнена автором самостоятельно, анализ данных проведен с использованием программы Microsoft Exсel 2016 и программного пакета IBM SPSS Statistics 23. Определяли средние значения (М), минимальные (min) и максимальные значения (max), среднеквадратическое отклонение (σ). Для оценки достоверности различий между средними значениями выборок применяли параметрический двусторонний t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при величине t-критерия менее 0,05 (p<0,05).
Результаты собственных исследований
Клинико-морфологическое исследование опухолей придаточного аппарата глаза 1 группа. Всего обследовано 86 пациентов (86 глаз) с опухолями век. При клиническом осмотре выявлено, что у 41 (47,7%) пациента опухоль локализовалась на верхнем веке, у 39 (45,3%) пациентов – на нижнем веке, у 1 (1,2%) пациента опухоль века расположена у наружного угла глаза, у 5 (5,8%) пациентов – у внутреннего угла.
По результатам гистологического исследования среди доброкачественных опухолей век (n=42) чаще встречали меланоцитарный невус, который верифицирован у 24 (57,1%) пациентов, плоскоклеточная папиллома диагностирована у 9 (21,4%) пациентов, у 8 (19,1%) пациентов установлен диагноз кератоза век (себорейный и фолликулярный), у 1 (2,4%) пациента обнаружена пиломатриксома. Среди злокачественных опухолей век (n=44) у превалирующего числа пациентов диагностирован базальноклеточный рак – 25 (56,8%) пациентов. Плоскоклеточный рак подтвержден у 9 (20,5%) пациентов. У 5 (11,4%) пациентов установлен диагноз аденокарциномы сальной железы. У 2 (4,6%) пациентов гистологически верифицирован диагноз меланомы кожи.
Также встречали следующие редкие опухоли: лимфома кожи – 1 (2,3%) пациент, злокачественная гемангиоэндотелиома – 1 (2,3%) пациент и злокачественная эккринная спираденома – 1 (2,3%). Расхождение клинического и гистологического диагноза составило при доброкачественных опухолях век 11,9%, при злокачественных опухолях век – 13,6%. Дифференциальная диагностика доброкачественных и злокачественных опухолей век представляла сложности, особенно на начальных стадиях развития злокачественных опухолей век (рисунок 2).
2 группа. Всего обследован 101 пациент (101 глаз) с опухолями конъюнктивы, среди которых доброкачественная опухоль диагностирована у 66 (65,3%) пациентов, у 35 (34,7%) пациентов подтверждена злокачественная опухоль. Чаще всего опухоли локализовались на бульбарной конъюнктиве с захватом области лимба – 44 (43,6%) случаев, из них в 26 (25,7%) случаях опухоль далее переходила на роговицу. На бульбарной конъюнктиве вне лимба опухоль локализовалась в 16 (15,8%) случаях, в области полулунной складки – в 10 (9,9%), в области слезного мясца – в 6 (5,9%) случаях, обе структуры – полулунную складку и слезное мясцо – опухоль захватывала в 11 (10,9%) случаях, распространение опухоли на пальпебральную конъюнктиву и своды из бульбарной конъюнктивы, слезного мясца и/или полулунной складки встречали в 14 (13,9%) случаях. В 10 (38,5%) случаях, когда опухоль распространялась на роговицу, в 12 (72,7%) случаях, когда опухоль переходила на своды и в 4 (36,3%) случаях, когда опухоль захватывала и полулунную складку, и слезное мясцо, – диагностировали злокачественный характер роста новообразования
В структуре доброкачественных новообразований конъюнктивы чаще встречали меланоцитарные опухоли: невусы конъюнктивы обнаруживали в 43 (65,2%) случаях, первичный приобретенный меланоз конъюнктивы – в 5 наблюдениях (7,6%).
Папиллома конъюнктивы выявлена в 7 (10,6%) случаях, полип конъюнктивы – в 5 (7,6%). Гемангиома, сложная хористома и липодермоид зафиксированы в 2 (3%), 3 (4,5%) и 1 (1,5%) случаях, соответственно. Среди злокачественных опухолей меланома конъюнктивы подтверждена в 15 (42,9%) случаях, плоскоклеточная поверхностная неоплазия конъюнктивы – в 16 (45,7%), лимфома конъюнктивы – в 4 (11,4%) случаях.
Полиморфность опухолей конъюнктивы затрудняет дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных опухолей. Расхождение клинического и гистологического диагноза составило при доброкачественных опухолях конъюнктивы 10,6%, при злокачественных опухолях конъюнктивы – 11,4%.
Плоскоклеточную карциному и интраэпителиальную неоплазию конъюнктивы следует дифференцировать от папилломы конъюнктивы. Меланома конъюнктивы может быть сходна клинически с невусом конъюнктивы и первичным приобретенным меланозом, причем она может развиться из ранее существовавшего меланоцитарного доброкачественного образования спустя многие годы (рисунок 3).
Восстановительная способность здоровых тканей
Восстановительная способность здоровых тканей век и конъюнктивы отличалась незначительно. Среднее значение интенсивности поглощения реакционных смесей с наночастицами серебра, сформированными в присутствии здоровых тканей из век составило 0,054±0,005, из конъюнктивы – 0,056±0,004. Максимальные значения интенсивности поглощения реакционных смесей достигали при концентрациях раствора Ag(NH3)2NO3 равной 63 мкг/мл и 31 мкг/мл на 5 и 10 минуте реакции восстановления, которые наблюдали преимущественно при длине волны λ=410 нм. Полученные данные учитывали при определении восстановительной способности опухолей придаточного аппарата глаза, где здоровые ткани выступают группой контроля.
Оптимальные значения основных параметров разработанного метода
Проведенное спектрометрическое исследование показало, что концентрация стандартного источника катионов серебра Ag(NH3)2NO3, равная 63 мкг/мл и 31 мкг/мл достаточна для формирования de novo наночастиц серебра при участии опухолей придаточного аппарата глаза. При доброкачественных опухолях не выявлено значимых различий восстановительной способности при концентрациях 31 мкг/мл и 63 мкг/мл, а при злокачественных опухолях при концентрации раствора 63 мкг/мл наблюдали значимо высокие показатели восстановительной способности, чем при 31 а б в мкг/мл. Поэтому дальнейшие сравнения восстановительной способности опухолей проведены при концентрации раствора 63 мкг/мл. Определены оптимальное время инкубации опухолей придаточного аппарата глаза c раствором Ag(NH3)2NO3 (минимальное время инкубации – 5 минут, максимальное – 20 минут), а также интенсивность поглощения реакционной смеси с наночастицами серебра, сформированными в присутствии опухолей придаточного аппарата глаза, которое достигает наибольших значений при длинах волн λ=410 нм, λ=415 нм и λ=420 нм.
Восстановительная способность доброкачественных опухолей придаточного аппарата глаза
Среди разных типов доброкачественных опухолей придаточного аппарата глаза не выявлено статистически значимых различий восстановительной способности.
Восстановительная способность доброкачественных опухолей век после 5 минуты реакции восстановления значимо не повышалась, но наибольшие значения восстановительной способности Ak наблюдали на 10 минуте реакции восстановления: невусы кожи век – Ak=2,1-2,4, кератозы век – Ak=2,1-2,3, папиллома век – Ak=1,2-1,8.
Восстановительная способность опухолей конъюнктивы отличалась в зависимости от длительности реакции восстановления: восстановительная способность меланоцитарного невуса достигала максимальных значений на 20 минуте реакции восстановления – Ak=2,1-2,3, первичного приобретенного меланоза на 10 минуте – Ak=2,5. Восстановительная способность плоскоклеточной папилломы и полипов после 5 минуты значимо не повышалась и составила Ak=1,4-2,2 и Ak=1,3-1,8, соответственно.
Средние значения восстановительной способности Ak других доброкачественных опухолей конъюнктивы варьировали от 1,1 до 1,4.
Восстановительная способность злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза
Злокачественные опухоли век (1 группа). Восстановительная способность базальноклеточного рака (Ak=3,4-3,6) и аденокарциномы сальной железы (Ak=2,6-3,1) после 10 минуты реакции восстановления, плоскоклеточной карциномы (Ak=3,2-3,3) после 5 минуты реакции восстановления значимо не повышалась. Различия восстановительной способности вышеуказанных опухолей незначимы (p>0,05).
Наибольшие средние показатели восстановительной способности среди злокачественных опухолей век наблюдали при меланоме век на 20 минуте реакции восстановления (Ak=6,9-8,1), но из-за небольшого числа наблюдений меланомы век, невозможно говорить о значимости превалирования восстановительной способности меланомы кожи над восстановительной способностью других злокачественных опухолей век. При других редких типах опухолей век среднее значение восстановительной способности Ak варьировало 3,4 до 4,9.
Злокачественные опухоли конъюнктивы (2 группа). Восстановительная способность плоскоклеточного рака (Ak=2,6-3,1) выше восстановительной способности интраэпителиальной неоплазии конъюнктивы (Ak=2,2-2,6) на 10 минуте реакции восстановления (p<0,03). При сравнительной оценке восстановительной способности злокачественных опухолей конъюнктивы на 5 минуте реакции восстановления обнаружено, что плоскоклеточный рак (Ak=3,6-3,8), интраэпителиальная неоплазия (Ak=3,5-3,6) и меланома конъюнктивы (Ak=3,3-3,5) практически в равной степени восстанавливали катионы серебра. С течением времени восстановительная способность эпителиальных злокачественных опухолей значимо не менялась, на 20 минуте восстановительная способность плоскоклеточного рака составила Ak=3,4-4,0, интраэпителиальной неопазии конъюнктивы – Ak=3,3-3,5.
Напротив, меланома конъюнктивы активно продолжала генерировать наночастицы серебра, что проявлялось в повышении величины Ak вплоть до 20 минуты реакции восстановления (Ak=6,6-7,6), разница величин Ak на 5 и 20 минуте реакции восстановления составила почти 2 раза (p<0,002). Это говорит о том, что меланома конъюнктивы активнее восстанавливает катионы серебра, чем эпителиальные опухоли конъюнктивы. Восстановительная способность лимфомы конъюнктивы составила Ak=4,3-4,5 на 5 минуте реакции восстановления, с течением времени показатели восстановительной способности значимо не повышались.
Сравнительная оценка восстановительной способности доброкачественных и злокачественных опухолей век
Новообразования век (1 группа) разделены на подгруппы в зависимости от происхождения опухоли:
А. Эпителиальные опухоли. Доброкачественные (n=17): папиллома век (n=9), кератоз (n=8). Злокачественные (n=34): базальноклеточный рак (n=25), плоскоклеточный рак (n=9).
Б. Меланоцитарные опухоли. Доброкачественные: невусы век (n=24).
Злокачественные: меланома век (n=2). В. Другие (n=9).
Анализ величины восстановительной способности проводили на 10 минуте реакции восстановления, так как при доброкачественных эпителиальных опухолях век не наблюдали значимого повышения величины Ak после 5 минуты реакции восстановления, а при злокачественных эпителиальных опухолях – после 10 минуты реакции восстановления. Обнаружено, что восстановительная способность злокачественных эпителиальных опухолей век выше восстановительной способности доброкачественных эпителиальных опухолей век (p<0,05) (рисунок 4).
Между восстановительной способностью доброкачественных и злокачественных меланоцитарных опухолей не проводили статистические вычисления ввиду малой выборки злокачественных меланоцитарных опухолей век (2 случая). Однако средние показатели восстановительной способности меланомы кожи в обоих случаях показывали бо́льшие значения, чем показатели восстановительной способности меланоцитарных невусов век уже с 5 минуты реакции восстановления (рисунок 5).
Таким образом, восстановительная способность злокачественных опухолей век выше, чем доброкачественных. Формирование биогенных наночастиц серебра можно фиксировать с 5 минуты реакции восстановления, но при некоторых типах опухолей (злокачественная меланома век) активная генерация наночастиц серебра может продолжаться вплоть до 20 минуты реакции восстановления.
Сравнительная оценка восстановительной способности доброкачественных и злокачественных опухолей конъюнктивы
Новообразования конъюнктивы (2 группа) разделены на подгруппы в зависимости от происхождения опухоли:
А. Эпителиальные опухоли.
Доброкачественные (n=12): плоскоклеточная папиллома (n=7), полип (n=5).
Злокачественные (n=16): плоскоклеточный рак (n=11), интраэпителиальная неоплазия умеренно тяжелой и тяжелой степени дисплазии (n=5).
Б. Меланоцитарные опухоли.
Доброкачественные (n=48): меланоцитарные невусы (n=43), первичный приобретенный меланоз (n=5).
Злокачественные: меланома конъюнктивы (n=15).
Другие (n=10).
Обнаружено, что восстановительная способность злокачественных эпителиальных опухолей конъюнктивы выше восстановительной способности доброкачественных эпителиальных опухолей конъюнктивы в среднем в 2 раза (p<0,05) (рисунок 6).
Восстановительную способность доброкачественных и злокачественных меланоцитарных опухолей конъюнктивы сравнивали по величине Ak, полученной по формуле (1) при следующих параметрах реакции:
• концентрация раствора Ag(NH3)2NO3 63 мкг/мл. Как было отмечено ранее, восстановительная способность доброкачественных опухолей конъюнктивы значимо не менялась в зависимости от концентрации источника катионов серебра, а восстановительная способность злокачественных опухолей конъюнктивы показывала наибольшую способность к восстановлению катионов серебра при концентрации раствора 63 мкг/мл.
• реакцию восстановления проводили 5, 10 и 20 минут, так как при меланоме конъюнктивы наблюдали активную генерацию наночастиц серебра вплоть до 20 минуты реакции восстановления.
• измерения проводили при длине волны λ=415 нм; величина Ak в зависимости от длин волн значимо не менялась ни при доброкачественных, ни при злокачественных меланоцитарных опухолях конъюнктивы, но наибольшие величины Ak фиксировали преимущественно при длине волны λ=415 нм.
При сравнительной оценке восстановительной способности меланоцитарных опухолей конъюнктивы обнаружено, что злокачественные меланоцитарные опухоли конъюнктивы в среднем в 2,5-3 раза активнее восстанавливают катионы серебра, чем доброкачественные меланоцитарные опухоли конъюнктивы (p<0,05). Разница восстановительной способности между доброкачественными и злокачественными меланоцитарными опухолями конъюнктивы наблюдается уже с 5 минуты реакции восстановления и продолжает повышаться с течением времени вплоть до 20 минут (рисунок 7).
Разработанный в данном исследовании метод предназначен для срочной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза и основан на спектрометрической регистрации уровня биогенного синтеза наночастиц из катионов серебра. Метод информативен как при дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных опухолей эпителиального происхождения, так и меланоцитарного происхождения. Внедрение в практику разработанного метода позволит расширить арсенал методов диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей век и конъюнктивы с целью последующего планирования тактики ведения пациента и определения объема хирургического вмешательства.
Злокачественные опухоли придаточного аппарата глаза отличаются агрессивным течением по сравнению с доброкачественными опухолями, что отражается в высоких значениях их восстановительной способности. Различная восстановительная способность разных типов опухолей придаточного аппарата глаза объясняется метаболической гибкостью. Среди всех злокачественных опухолей наибольшую восстановительную способность проявляет меланома, которая является крайне агрессивной опухолью с наибольшим уровнем потребления глюкозы.
Выводы
1. Анализ клинической картины опухолей придаточного аппарата глаза подтвердил, что определение их доброкачественности или злокачественности до операции затрудняется многообразием клинических форм. Расхождение клинического и гистологического диагноза при доброкачественных и злокачественных опухолях придаточного аппарата глаза варьирует от 10,6% до 13,6%.
2. Разработанный метод экспресс-диагностики на основе биогенного синтеза наночастиц серебра позволяет установить доброкачественность или злокачественность опухолей придаточного аппарата глаза в пределах 20 минут.
3. При оптимизации основных параметров метода установлено, что формирование биогенных наночастиц серебра при участии здоровых и опухолевых тканей наиболее показательно при концентрации источника катионов серебра Ag(NH3)2NO3 равной 63 мкг/мл, длительности реакции восстановления до 20 минут при температуре 37оС.
4. Впервые показана способность здоровых тканей век и конъюнктивы выступать в роли биологического восстановителя катионов серебра с формированием наночастиц de novo. Среднее значение восстановительной способности здоровых тканей век и конъюнктивы было примерно одинаковым и составило 0,056±0,004 и 0,054±0,005 соответственно.
5. Впервые показана способность опухолей придаточного аппарата глаза восстанавливать катионы серебра с формированием наночастиц de novo. Было установлено, что доброкачественные опухоли придаточного аппарата глаза разного гистогенеза до 2,6 раз активнее восстанавливают катионы серебра, чем здоровые ткани той же тканевой принадлежности, злокачественные опухоли придаточного аппарата глаза – до 8,1 раз.
6. Показано, что злокачественные опухоли придаточного аппарата глаза активнее восстанавливают катионы серебра, чем доброкачественные опухоли. Восстановительная способность злокачественных эпителиальных опухолей в среднем в 1,7-2,2 раза выше, чем восстановительная способность доброкачественных эпителиальных опухолей, а восстановительная способность злокачественных меланоцитарных опухолей в 2,8-4,1 раза выше, чем восстановительная способность доброкачественных меланоцитарных опухолей.
7. Установлено, что восстановительная способность злокачественных новообразований придаточного аппарата глаза отличается у разных морфологических типов опухолей. Наибольшей восстановительной способностью обладают злокачественные меланоцитарные опухоли, которые в среднем в 6,1 раз активнее восстанавливают катионы серебра по сравнению со здоровыми тканями, и в среднем в 2,4 раза активнее, чем злокачественные эпителиальные опухоли.
Практические рекомендации
1. При сложных дифференциально-диагностических случаях с целью уточнения доброкачественности и злокачественности опухолей придаточного аппарата глаза рекомендуется использовать экспресс-метод определения восстановительной способности опухолей с помощью наночастиц серебра.
2. При заборе материала для исследования следует брать биоптаты сразу после удаления опухоли из глаза, а контрольную здоровую ткань необходимо взять из того же глаза.
3. При определении восстановительной способности эпителиальных опухолей придаточного аппарата глаза максимальной является длительность реакции восстановления 10 минут, меланоцитарных опухолей – 20 минут.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Пат. № 2776647 Российская Федерация МПК B82B 1/00 (2006.01). G01N 21/00 (2006.01). Способ экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы: № 2021139500: заявл. 29.12.21 : опубл. 22.07.22 / Саакян С. В., Алексеева А. П., Складнев Д. А., Сорокин В. В., Цыганков А. Ю., Безнос О. В. : Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России). – 2 с. – Текст: непосредственный.
2. Возможности спектрометрической диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей конъюнктивы / С.В. Саакян, Д.А. Складнев, А.П. Алексеева [и др.] // Российский офтальмологический журнал. – 2023. – Т. 16, № 2. – С. 119-123.
3. Роль инструментальных методов диагностики в оценке метаболического статуса опухолей придаточного аппарата глаза / С.В. Саакян, Д.А. Складнев, А.П. Алексеева [и др.] // Head and neck. Голова и шея. Российский журнал. – 2024. – Т. 12, №1. – С. 128–135.
4. Разработка нового нанобиотехнологического метода и его применение для дифференциальной диагностики опухолей придаточного аппарата глаза / С.В. Саакян, Д.А. Складнев, А.П. Алексеева [и др.] // Клиническая офтальмология. – 2024. – Т. 24, №1. – С.21-24.
5. Экспресс-диагностика злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза на основе синтеза биогенных наночастиц / С.В. Саакян, Д.А. Складнев, А.П. Алексеева [и др.] // Head and neck. Russian Journal. – 2022. – Т. 10, № 2 (2). – C. 94-97.
6. Клинико-экспериментальное обоснование нанобиотехнологического метода экспрессдиагностики опухолей придаточного аппарата глаза / А.П. Алексеева, С.В. Саакян, Д.А. Складнев [и др.] // Успехи молекулярной онкологии. – 2021. – T. 8, № 4. – С. 78.
7. Инновационный нанобиотехнологический метод экспресс-диагностики злокачественных опухолей придаточного аппарата глаза / С.В. Саакян, Д.А.Складнев, А.П.Алексеева [и др.] // Сборник научных трудов научно-практической конференции с международным участием XIV Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2021. – T.2. – C. 536-538.
8. Сравнительная характеристика восстановительной активности опухолей придаточного аппарата глаза по их способности формировать биогенные наночастицы серебра / С.В. Саакян, Д.А.Складнев, А.П.Алексеева [и др.] // Сборник научных трудов научно-практической конференции с международным участием XV Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2022. – T.2. – С. 434-435.
9. Генерация наночастиц металлов как метод оценки метаболической активности клеток / Д.А. Складнев, В.В. Сорокин, А.П. Алексеева, С.В. Саакян // Тезисы докладов VIII Ежегодной научной конференции ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН. – 2022. – С. 30/
Список сокращений и условных обозначений
мкг/мл – микрограмм на миллилитр
нм – нанометр
A – величина оптической плотности
Ag(NH3)2NO3 – раствор аммиаката серебра
оС – градус Цельсия
λ – длина волны
