Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
Ченцова Екатерина Валериановна – доктор медицинских наук, профессор.
Официальные оппоненты:
Чурашов Сергей Викторович – доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии «Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова» МО РФ.
Измайлова Светлана Борисовна – доктор медицинских наук, заведующая отделом трансплантационной и оптико-реконструктивной хирургии переднего отрезка глазного яблока ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Общая характеристика работы
Актуальность темы
Согласно данным ВОЗ (2020г.) (Lancet Global Health 2020) на долю заболеваний роговицы приходится около четверти всех глазных болезней, а слепота, вызванная повреждениями роговицы, составляет от 4 до 5% во всём мире. В Российской Федерации проблема стоит ещё более остро, ведь по данным за 2010г 5,9% слепых и слабовидящих приходится на роговичную слепоту. Частой причиной роговичной слепоты выступают персистирующие эрозии роговицы, осложняющиеся язвенными поражениями, которые относятся к числу тяжёлых патологий, трудно поддающихся лечению. При ряде патологических состояний процессы эпителизации роговицы нарушаются, а порой не достигаются вовсе, что приводит к извращению регенераторных механизмов. Эрозии роговицы, сохраняющиесяd в течение 2-х недель, называются персистирующими эрозиями роговицы (ПЭР) (Tsubota K. et al., 1999). В современной литературе встречаются сроки 10-14 дней (Sanchez-Huerta V. et al., 2022. Scranton S. et al., 2023). В понятие персистирующих дефектов роговицы (ПДР) мы включаем ПЭР и персистирующие язвы, которые не поддаются консервативному лечению более 21-го дня. Медленная эпителизация или полное её отсутствие создают условия для инфицирования, истончения, рубцевания и перфорации роговицы, что, в свою очередь, может привести к снижению зрения и даже гибели глаза. Лечение подобных состояний роговицы является трудной и актуальной задачей в офтальмологии.
В литературе описано множество консервативных и хирургических методов борьбы с персистирующими эрозиями и их осложнениями, но все они не лишены недостатков и имеют противопоказания. Среди хирургических методов лечения ПЭР выделяется трансплантация амниотической мембраны, получившая широкое распространение в мировой практике. С начала ее применения в офтальмологии (de Rotth A., 1940) по сей день этот метод не утратил актуальности в виду его эффективности, широким показаниям и минимальному количеству возможных побочных эффектов. Амниотическая мембрана, помимо того, что является прекрасной биологической повязкой, обладает способностью к активации эпителизации, супрессии воспаления и рубцевания, ингибированию воспаления и антимикробным эффектом. Но использование свежего нативного амниона в медицинской практике затруднено в связи с коротким сроком хранения, поэтому амниотические мембраны консервируют для удобства применения, что снижает клинический эффект их применения. Мы ставим перед собой цель восполнить недостающие факторы роста в амнионе путём пропитывания его аутолизатом богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), который несёт в себе 30 биоактивных протеинов, а так же цитокины, включая тромбоцитарный фактор роста-AB, сосудистый эндотелиальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов и инсулиноподобный фактор роста-1, среди прочих. Лейкоциты не попадают в БоТП во время приготовления, что снижает содержание провоспалительных белков (IL-1b, IL- 16 и др.). (Anitua E. et al., 2006. Nurden A.T. et al., 2008).
Согласно данным литературы и исследовательских работ, проведенных на базе отдела травматологии и реконструктивной хирургии ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава России, богатая тромбоцитами плазма может быть использована в качестве совместного лечения в связке с амниотической мембраной (Kshersagar J., et al., 2018. Федосеева Е.В. и соавт., 2022,).
Цель исследования - разработать методику и изучить эффективность применения амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП, при персистирующих дефектах роговицы различного генеза.
Задачи исследования
1. Изучить регенеративные свойства АМ после обработки лизатом БоТП в экспериментах in vitro.
2. Оценить результаты трансплантации АМ, обогащенной аутолизатом БоТП, у пациентов со свежими ожогами глаз и их последствиями.
3. Изучить воздействие трансплантации АМ, обогащённой аутолизатом БоТП, на заживление дефектов роговицы при персистирующих язвах.
4. Проанализировать результаты применения АМ, обогащённой аутолизатом БоТП, у пациентов с замедленной эпителизацией после кератопластики высокого риска.
5. Разработать алгоритм комплексного лечения и профилактики персистирующих дефектов роговицы.
Научная новизна
1. Впервые предложен способ насыщения консервированного амниона факторами роста (патент РФ на изобретение № 2782129 от 31.03.2022 г.).
2. Впервые в эксперименте in vitro, проведено сравнение эффекта стимуляции деления клеток буккального эпителия человека с помощью обычных и насыщенных лизатом БоТП амниотических мембран, консервированных различными методами.
3. Впервые в эксперименте in vitro выявлен лучший способ консервации амниотической мембраны, для насыщения её факторами роста лизата БоТП.
4. Впервые проведено сравнительное исследование воздействия на эпителизацию персистирующих дефектов роговицы различного генеза амниотической мембраны «Флексамер», насыщенной аутолизатом БоТП и без насыщения.
5. Впервые предложена методика профилактики ПЭР у пациентов после сквозной кератопластики высокого риска, заключающаяся в активной хирургической тактике — покрытии амниотической мембраной, насыщенной лизатом БоТП.
Практическая значимость работы
1. Разработанный нами способ лечения ПЭР с применением трансплантации лиофилизированной амниотической оболочки, насыщенной лизатом БоТП, позволит открыть новые перспективы для лечения дефектов роговицы, сократить сроки заживления, а также сформировать более прозрачную роговичную ткань за счет совместного действия амниотической мембраны и факторов роста из гранул тромбоцитов, обеспечив высокие клинико-функциональные результаты лечения.
2. Применение амниотической мембраны, насыщенной аутолизатом БоТП, в профилактике ПЭР у пациентов после сквозной кератопластики высокого риска, позволяет сократить сроки эпителизации и получить лучший биологический результат приживления трансплантата.
Методология и методы исследования
Последовательное применение методов научного познания было избрано методологической основой диссертационного исследования. Работа выполнена с использованием комплексного подхода, включающего экспериментальные, клинические и инструментальные методы. Использование современных методов математико-статистического анализа позволило сформулировать выводы и практические рекомендации.
Положения, выносимые на защиту
1. Лучшим методом консервации амниотической мембраны для насыщения её лизатом БоТП является лиофилизация.
2. Экспериментально доказано, что для насыщения лиофилизированной амниотической мембраны лизатом БоТП достаточно 3-5 минут.
3. Применение насыщенного факторами роста консервированного амниона ускоряет эпителизацию и снижает отёк роговицы у пациентов с ПЭР после свежих ожогов.
4. Использование насыщенного факторами роста консервированного амниона ускоряет эпителизацию и способствует восстановлению толщины стромы роговицы после язвенных поражений.
5. Лечение и профилактика ПЭР после сквозной кератопластики высокого риска с помощью лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП, приводит к быстрой эпителизации и более прозрачному приживлению роговичного трансплантата, а также к меньшему числу отторжений.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационного исследования: в анализе состояния вопроса по данным современной литературы, в определении цели и задач, выборе методов исследования, статистической обработке полученных результатов исследования с последующей интерпретацией, формулировании положений на защиту, выводов и практических рекомендаций. Принято активное участие в дизайне и выполнении экспериментов, а также полностью самостоятельно выполнен клинический этап.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований и разработанный метод лечения персистирующих дефектов роговицы внедрены в практическую деятельность отдела травматологии и реконструктивной хирургии ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Материалы диссертации включены в программы лекций на курсах повышения квалификации специалистов и сертификационных циклов последипломного образования для врачей офтальмологов, проводимых на базе ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Степень достоверности и апробация полученных результатов исследования
Степень достоверности диссертационного исследования обоснована методологической обоснованностью, научно-теоретическим и логическим аргументированием экспериментальных методов исследования, сроком наблюдения и использования современной аппаратуры. Необходимая полнота и корректность результатов статистической обработки данных обеспечена полнотой выборки и методами математико-статистической обработки.
; Основные положения диссертации были изложены и обсуждены на XV Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2023), XVI Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2024)
Апробация диссертации состоялась 4 октября 2023 года на заседании межотделенческой конференции ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в научных журналах, рецензируемых Высшей Аттестационной Комиссией Министерства науки и высшего образования Российской Федерации. Получен патент РФ на изобретение № 2782129 от 31.03.2022.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 132-х страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 22 рисунка. Работа состоит из введения и 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, а также заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы состоит из 212 источников, из них 33 отечественных и 179 иностранных публикаций.
Содержание диссертации
Материалы и методы экспериментального исследования
Совместное исследование и изготовление лизата БоТП проводили на базе отделения биотехнологий и трансфузиологии НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. В работе исследовали трансплантаты амниона человека, консервированные 3-мя способами: силиковысушивание, лиофилизация, криоконсервирование. В качестве источника тромбоцитов использовали кровь здоровых добровольцев.
Из крови доноров выделяли богатую тромбоцитами плазму (БоТП) с содержанием тромбоцитов свыше 1000 тыс/мкл, которую затем замораживали при -80°С и размораживали при 0-4°С с целью получения лизата тромбоцитов БоТП. В процессе экспозиции АМ с лизатом БоТП определяли оптимальное время насыщения консервированных АМ лизатом, оценивали объем лизата, который может адсорбировать 1 см2 АМ путём взвешивания сухого амниона и насыщенного амниона 1,2,3,5,10 и 15 минут после начала пропитывания.
Для оценки рост-стимулирующего эффекта трансплантатов амниона исследовали следующие группы: 1-я опытная группа – амнион без лизата БоТП и Контроль 1 – без амниона и без лизата БоТП; 2-я опытная группа – образцы амниона, совмещенные с лизатом БоТП и Контроль 2 – лизат БоТП без амниона.
Исследование проводили на культуре буккального эпителия человека 3-5 пассажа, который идентичен клеткам роговичного эпителия. Динамику роста клеток оценивали через 1, 2 и 3 суток с момента посева. Число клеток и их жизнеспособность оценивали с помощью оригинальных методов, основанных на витальном окрашивании клеток и их исследовании во флюоресцентном микроскопе.
Число клеток и их жизнеспособность оценивали с помощью оригинальных методов, основанных на витальном окрашивании клеток красителями трипафлавин-акридиновый оранжевый и трипафлавин-родамин С и их исследовании в конфокальном микроскопе, совмещенным с флюоресцентной лампой.
Материалы и методы клинического исследования
Работа выполнена в ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» (директор – академик РАН, профессор, д.м.н. Нероев В.В.) на базе отдела травматологии и реконструктивной хирургии (начальник – к.м.н., Илюхин П.А.), отдела инфекционных и аллергических заболеваний глаз (И.о. начальника – к.м.н., Яни Е.В.). На реализацию исследования (экспериментальной и клинической части) получено одобрение Комитета по этике НМИЦ ГБ им. Гельмгольца (протокол №53/2 от 08.04.2021 года).
В клиническом исследование приняли участие 80 человек. Пациенты были разделены на 3 группы по этиологии возникновения ПДР: 1-я группа – персистирующие эрозии после сквозной кератопластики высокого риска, 2-я группа – персистирующие эрозии после свежих ожогов и 3-я группа – персистирующие язвы. Каждая группа была разделена на 2 подгруппы: основная подгруппа, обозначающаяся «а» (для лечения ПДР использовали лиофилизированная амниотическая мембрана «Флексамер», насыщенную лизатом БоТП) и подгруппа сравнения, обозначающаяся «б» (применялась лиофилизированная амниотическая мембрана «Флексамер» без лизата БоТП).
Покрытие амниотической мембраной применяли после безуспешного консервативного лечения: инстилляции антибиотика, дексаметазона, антиоксиданта, кератопротектора, парабульбарных инъекций стероидов и стимуляторов регенерации. В группе 1 (персистирующие эрозии после сквозной кератопластики высокого риска) в лечение дополнительно включали внутривенные инъекций дексаметазона, применения селективного иммуносупрессора микофенолата мофетила под прикрытием высоких доз противовирусной терапии ацикловиром или валацикловиром.
Срок наблюдения составил 12 месяцев.
В 1-ой группе (ПЭР после кератопластик высокого риска) под нашим наблюдением находилось 40 пациентов, которых разделили на 2 подгруппы по 20 человек в зависимости от метода лечения. Основная подгруппа 1а и подгруппа сравнения 1б.
Если за 10 дней не наступала полная эпителизация мы прибегали к покрытию амниотической мембраной без прекращения консервативной терапии в обеих подгруппах. Если за 5 дней не наступала эпителизация 50% кератотрансплантата, то эрозия считалась потенциально персистирующей, и мы применяли покрытие амниотической мембраной в профилактических целях.
В основную подгруппу 1а с ПЭР после сквозной кератопластики высокого риска вошло 20 пациентов, 11 мужчин и 9 женщин в возрасте от 34 и до 84 лет с деэпителизацией в среднем 66% кератотрансплантата в течение 5-10 дней после операции. Среди пациентов основной подгруппы с ПЭР после СКП было 9 человек с рекератопластикой, 7 – с ожоговыми васкуляризированными бельмами 3-4 категории, 3 – с поствоспалительными бельмами и один – с язвой и перфорацией роговицы. Из 9 пациентов с рекератопластиками причиной первой СКП было в 3-х случаях ожоговое бельмо, в 2-х в бельмо после проникающего ранения роговицы, в одном язва с угрозой перфорации, в 2-х поствоспалительное бельмо, и в одном ЭЭД.
В подгруппе сравнения 1б наблюдалось так же 20 пациентов, 13 мужчин и 7 женщины, в возрасте от 41 до 80 лет, с аналогичными эрозиями площадью 67% кератотрансплантата в те же сроки. Среди пациентов подгруппы сравнения было 10 рекератопластик, 6 ожоговых бельм 3-4 категории, 2 поствоспалительных бельма и 2 инфекционные язвы с угрозой перфорации. Из 10 пациентов с рекератопластиками причиной первой СКП было в 3-х случаях ожоговое бельмо, в 3-х бельмо после проникающего ранения роговицы, в 2-х язва с угрозой перфорации, 1 поствоспалительное бельмо, 1 кератоконус.
Во 2-ю группу (с эрозиями после свежих ожогов) включен 21 пациент.
В основную подгруппу 2а взяли 10 пациентов (7 мужчин и 3 женщины), в возрасте от 29 и до 67 лет. У 9 из них был щелочной ожог (3 средних ожога и 6 тяжёлых) и у одного - тяжёлый кислотный ожог.
В подгруппе сравнения со свежими ожогами наблюдали 11 пациентов (8 мужчин и 3 женщины) в возрасте от 31 до 52 лет. Из 11 человек у 10 был щелочной ожог (4 средних ожога и 5 тяжёлых) и 1 тяжёлый кислотный ожог.
Площадь деэпителизации роговицы в обеих подгруппах была сопоставимой и составляла в среднем 60% роговицы. Толщина отёчной стромы составляла 821 мкм и 817 мкм в основной 2а подгруппе и подгруппе сравнения 2б, соответственно.
В 3-ю группу (с персистирующими язвами роговицы) вошло 19 пациентов. Все язвы располагались в центральной или парацентральной зоне.
В основную подгруппу 3а вошли 10 пациентов (4 мужчины и 6 женщин) в возрасте от 41 до 81 лет.
В подгруппе сравнения 3б наблюдали 9 пациентов (5 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 47 до 74 лет.
Толщина роговицы в проекции язвы у пациентов основной подгруппы и подгруппы сравнения была схожа и составляла 382 мкм и 393 мкм, соответственно.
Критерии оценки эффективности лечения:
Для 1-й группы после кератопластики высокого риска – сроки эпителизации, количество покрытий амнионом, биологический результат кератопластики через 12 месяцев наблюдения.
Для 2-й группы с эрозиями после свежих ожогов и 3-й с персистирующими язвами – сроки эпителизации, количество покрытий амнионом и изменение толщины роговицы по данным ОКТ.
Техника покрытия роговицы амниотической мембраной
Предоперационная подготовка проводилась следующим образом. В стерильных условиях операционной в конъюнктивальную полость оперируемого глаза закапывали антибактериальные капли (например, Офтаквикс). Операционное поле обрабатывали раствором бетадина, разбавленного с 0,09% физиологического раствора в соотношении 1:1.
Для обезболивания применяли инстилляцию 0,5% раствора проксиметакаина, после чего выполняли ретробульбарную или субконъюнктивальную анестезию 2% лидокаином. Выбор метода анестезии зависел от состояния конъюнктивы и ширины глазной щели.
Лиофилизированную амниотическую мембрану «Флексамер» размером 4 см² помещали эпителиальной стороной вниз в стерильный контейнер объемом 100 мл, содержащий 2 мл лизата богатой тромбоцитами плазмы. Данный объем обеспечивал полное погружение и пропитывание мембраны независимо от ее размеров. Экспозиция в лизате длилась 5 минут, что, согласно экспериментальным данным которые будут представлены далее, является достаточным для полного насыщения.
; Выполняли покрытие всей роговицы амниотической мембраной, и фиксировали к эписклере в 2 мм от лимба непрерывным швом 10-0. Излишки мембраны удаляли, оставляя ее края на 1–2 мм за пределами линии шва.
Амнион ориентировали стромальной стороной к роговице, так как стромальный слой обладает максимальной способностью к впитыванию лизата БоТП.
Дополнительно мембрану фиксировали мягкой контактной линзой.
Конструкцию сохраняли от 7 до 14 дней, после чего производилось удаление амниона для оценки состояния роговицы. Критериями для удаления амниона были: достоверная полная эпителизация роговицы, лизис амниона, его отрыв от швов, 14-й день применения независимо от состояния амниона и эпителия. При необходимости процедуру повторяли.
Методы исследования
Комплексное обследование пациентов включало: биомикроскопию переднего отрезка глаза, флюоресцеиновую пробу, фоторегистрацию, расчет площади поражения, а также оптическую когерентную томографию (OCT) роговицы у пациентов из 2-й группы с эрозиями после свежих ожогов и 3-й группы с персистирующими язвами.
Подсчёт площади деэпителизации во всех группа проводили по цифровым фотографиям глаз пациентов, окрашенных флюоресцеином, в программе Photoshop, а именно с помощью инструмента «Гистограмма» с подсчётом окрашенных и неокрашенных флюорисцеином пикселей на роговице.
Статистическая обработка
Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием приложения Microsoft Exсel 2016, при помощи пакета статистического анализа Statistica 10 («StatSoft», США) и «IBM SPSS Statistics 22» («SPSS» США). Выборки соответствовали разбивке пациентов по группам. При анализе данных рассчитывали медианы (Ме) с квартилями и средние величины параметров (M) и их среднеквадратичное отклонения (σ) с доверительным интервалом 95%.
Данные представлены в работе в виде Me [Q1; Q2]; М±σ. Все выборки подчиняются нормальному закону распределения. Для сравнения количественных данных в двух несвязанных между собой выборках использовали t-критерий Стьюдента и Uкритерий Манна-Уитни. Для выборок маленьких размеров применяли точный тест Фишера. Различия между значениями считали достоверными при уровне значимости более 95% (р<0,05).
Результаты собственных экспериментальных исследований
Определение оптимального времени для насыщения амниона лизатом БоТП
При нанесении лизата БоТП на поверхность консервированных АМ во всех случаях масса трансплантатов заметно увеличивалась уже через 1 минуту экспозиции. Для силиковысушенных АМ увеличение составило в среднем 4,2 раза, для лиофилизированных АМ – 4,8 раз, для криоконсервированных АМ - 1,8 раз. При более длительной экспозиции (5-15 мин) изменения массы АМ в присутствии лизата БоТП уже не наблюдалось.
Таким образом, продолжительность 3-5 мин является достаточной для насыщения консервированных АМ лизатом. Образцы лиофилизированных АМ площадью 0,25 см2 среднем образцы адсорбировали 1,60±0,18 мг лизата БоТП, что в пересчете на 1 см2 составляет 6,4 мкл лизата БоТП. Такой объем БоТП содержит оценочно 60-65 пикограмм тромбоцитарного фактора роста PDGF и 50-54 пикограмм эпидермального фактора роста EGF (Макаров М.С. и соавт., 2013).
Образцы силиковысушенных АМ впитали 1,33±0,09 мг лизата БоТП, а образцы криконсервированных – 1,13±0,51 мг. Объем лизата, адсорбированной лиофилизированными АМ, был достоверно выше, чем при использовании силиковысушенных и криоконсервированных АМ (р<0,05). Данное исследование показывает, что для насыщения консервированных АМ наиболее оправданно использовать лиофилизированные образцы.
Оценка рост-стимулирующего эффекта консервированного амниона, лизата БоТП и амниона, насыщенного лизатом БоТП
Все образцы амниона без добавления лизата БоТП не вызывали нарушения структурной целостности клеток и снижения их пролиферативной активности в течение всего срока культивирования. При витальном окрашивании в составе АМ, полученных путем силиковысушивания и лиофилизации, не было выявлено жизнеспособных клеток, в то время как в образцах криоконсервированной АМ можно было отчетливо видеть эпителиальные клетки с нормальной структурой ядер и цитоплазмы, секреторные везикулы выявлялись очень слабо или вообще не выявлялись.
Независимо от способа консервирования, все образцы АМ не давали рост-стимулирующего эффекта в культуре в течение всего срока наблюдения по сравнению с группой Контроль 1 (буккальный эпителий без стимуляции амнионом и лизатом БоТП) (Рис.1).
В опытах с лизатом БоТП без амниона (Контроль 2) на дне всех лунок формировалась фибриновая пленка, что несколько затрудняло рост клеток на 1- 2 сутки и достоверный рост-стимулирующий эффект был отмечен только на 3 сутки (p<0,05).
В опытах, где консервированные образцы АМ совмещали с лизатом БоТП, выраженная стимуляция роста наблюдалась при использовании лиофилизированных АМ. В присутствии комбинации лиофилизированных АМ и лизата БоТП число клеток в 1,3-1,4 раза (р<0,05) превышало аналогичный параметр в опытах с лизатом БоТП без АМ (Контроль 2) в течение всего срока исследования (Рис. 2).
Эксперименты в группе силиковысушенного амниона и лизат БоТП показали, что число клеток буккального эпителия было выше, чем в контроле 2 (лизат БоТП без амниона), однако статистически значимым это различие было только на 1 сутки.
В опытах, где лизат БоТП совмещали с криоконсервированным амнионом, число клеток статистически не отличалось от опытов с лизатом без АМ, т.е. в данном случае не удавалось получить выраженной стимуляции роста. Таким образом, лиофилизация является наиболее предпочтительной обработкой амниона для последующего насыщения его лизатом БоТП.
Результаты собственных клинических исследований
Анализ результатов заживления ПДР при использовании амниона, насыщенного лизатом БоТП у пациентов после сквозной кератопластики высокого риска
В основной подгруппе 1а применение насыщенного лизатом БоТП лиофилизированного амниона привело к полной эпителизации у 17 пациентов (85%), у 3-х пациентов так и не удалось добиться эпителизации, что привело к необходимости тотальной аутоконъюнктивальной пластики или рекератопластики. При этом из 17 случаев успешной эпителизации эрозии, у 13 пациентов было достаточно однократного применения насыщенной амниотической мембраны. Средний срок лечения пациентов составил 19 дней, что на 38,7% быстрее, чем в группе сравнения.
За 12 месяцев наблюдения только у одного больного был зафиксирован рецидив эрозии роговичного трансплантата. Консервативная терапия эпителиопатии, не требующей повторного покрытия амнионом, понадобилась только двум пациентам. Результаты наглядно представлены в Таблице 1.
У пациентов подгруппы сравнения 1б полную эпителизацию ПЭР отмечали только у 14 пациентов из 20 (70%). До полной эпителизации роговицы одного покрытия АМ достаточно было только 8 пациентам из 14.
Средний срок лечения пациентов составил 31 день. Консервативная терапия эпителиопатий, потребовалась в 11 случаях, что достоверно больше, чем в основной подгруппе (р<0,05, точный критерий Фишера). Рецидив эрозии наблюдали у четырех пациентов из 14.
Через 12 месяцев в основной подгруппе из 17 сохранённых кератотрансплантатов было 9 (53%) прозрачных и 8 (47%) полупрозрачных приживлений. Биологический эффект в подгруппе сравнения – 6 (42%) прозрачных, 5 (35%) полупрозрачных и 3 (22%) мутных кератотрансплантата из 14 прижившихся.
Анализ результатов заживления ПДР при использовании амниона, насыщенного лизатом БоТП у пациентов с ожоговой травмой глаз
В основной подгруппе 2а (10 человек) у пациентов со свежими ожогами среднее время полной эпителизации составило 1,28±0,21 месяца (38,4 дня). В 3- х случаях из 10 эпителизация была достигнута после первого покрытия амниотической мембраной. Дважды применение амниона с лизатом аутологичной БоТП понадобилось в 3-х случаях. У 3-х пациентов до полной эпителизации было применено 3 покрытия. И лишь у одного потребовалось 4 покрытия. Как видно из Таблицы 2, за 12 месяцев не было зафиксировано ни одного рецидива.
Толщина стромы к моменту полной эпителизации по данным ОКТ сократилась на 247,7±38,5 мкм, что свидетельствует об уменьшении отёка (Рис. 4).
У пациентов подгруппы сравнения 2б (11 человек) до достижения полной эпителизации роговицы потребовалось 1,75±0,17 месяца (52,5 дня).
При этом ни в одном случае не было достаточно одного покрытия: в 6 случая понадобилось 2 покрытия, в 3-х понадобилось 3 покрытия и в 2-х – 4 покрытия, что составляет 2,6 покрытия на человека в среднем. Особо отметим, что 5 пациентам из 11 с ожоговым поражением роговицы потребовалась дальнейшая стандартная консервативная терапия после снятия амниона в связи с сохранившимися эрозиями и эпителиопатиями, различия с основной подгруппой статистически значимы (точный критерий Фишера, р=0,02).
Толщина отёчной роговицы у пациентов с ожогами в момент эпителизации сократилась на 193±45,1 мкм. Так же за период 6-месячного наблюдения было зафиксировано 2 рецидива.
Можно сделать вывод, что применение насыщенного факторами роста лиофилизированного амниона у пациентов с ПЭР после свежих ожогов ускоряет эпителизацию на 27%, снижает отёк роговицы к моменту эпителизации на 28% быстрее по сравнению с обычным амнионом.
Анализ результатов заживления ПДР у пациентов с персистирующими язвами роговицы
В основной подгруппе 3а (10 человек) среднее время полной эпителизации составило 1,21±0,22 месяца (36 дней). Из десяти пациентов в восьми случаях было достаточно 1 покрытия насыщенным амнионом, в одном – 2-х и в одном – 3-х. За 12 месяцев не зафиксировано ни одного рецидива, что представлено в Таблице 3.
Толщина роговицы в месте язвы к моменту полной эпителизации по данным ОКТ увеличилась в среднем на 62,5 мкм (Рис. 5).
У пациентов подгруппы сравнения 3б (9 человек) до достижения полной эпителизации роговицы потребовалось 1,6 ±0,26 месяца (48 дней). При этом 1 покрытия было достаточно пяти пациентам, 2 покрытия амнионом для двух пациентов и 3 покрытия для оставшихся двух пациентов.
Толщина роговицы в месте язвы увеличилась в среднем на 42 мкм, что меньше, чем в основной подгруппе. Так же стоит отметить, что был зафиксирован 1 рецидив.
По результатам исследования можно сделать вывод, что использование насыщенного факторами роста консервированного амниона для лечения персистирующих язв роговицы ускоряет эпителизацию в среднем на 25% и способствует восстановлению толщины роговицы на 49% больше, чем обычный консервированный амнион.
Алгоритм профилактики и комплексного лечения ПЭР
На основании проведенных исследований нами разработан алгоритм профилактики и лечения ПДР с применением лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП.
Для профилактики и лечения персистирующих дефектов роговицы и их грозных осложнений мы предлагаем комплексный подход, включающий стандартную медикаментозную терапию и активную хирургическую тактику, заключающуюся в применении лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП, позволяющей достичь высокой концентрации факторов роста в течение длительного времени, а также эффекта биологической повязки. Насыщенная лизатом БоТП АМ накладывается на срок 7-14 дней с повторением процедуры при необходимости. При эпителизации эрозии роговицы, но сохраняющейся эпителиопатии, лечение можно продолжить с помощью стандартной медикаментозной схемы лечения.
Таким образом, нами разработан алгоритм хирургического лечения и профилактики персистирующих дефектов роговицы различного генеза:
1. Если после сквозной пересадки роговицы высокого риска в течение 5 дней не наступает эпителизации более 50% площади трансплантата, то эрозию можно считать потенциально персистирующей и приступать к профилактике различных осложнений (изъязвление, истончение, перфорация, отторжение, помутнение трансплантата). В таком случае нами рекомендовано применять покрытие роговицы лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом аутологичной БоТП для ускорения эпителизации и вследствие этого улучшения биологического эффекта приживления трансплантата.
2. При свежих средних и тяжёлых ожогах глаз для профилактики ПЭР, а также для лечения уже подтверждённого ПЭР рекомендуется активная хирургическая тактика, включающая покрытие роговицы лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП, для ускорения эпителизации. Покрытие амниотической мембраной в кратчайшие сроки приводит к снижению жалоб пациентов на боль, светобоязнь, блефароспазм, что облегчает процесс выздоровления.
3. Для лечения персистирующих язв роговицы, не поддающихся консервативному лечению в течение 21 дня, мы рекомендуем использование лиофилизированной амниотической мембраны, насыщенной лизатом БоТП, что позволяет предотвратить дальнейшее прогрессирование язвенного процесса, ускорить эпителизацию поверхности язвы и облегчить жалобы пациента.
Выводы
1. Наиболее оптимальным методом консервации амниотической мембраны для максимального насыщения её лизатом БоТП является лиофилизация, т.к. лиофилизированный амнион способен впитать на 21% больше лизата БоТП, чем силиковысушенный и на 45% больше, чем криоконсервированный.
2. На основании проведённых экспериментальных исследований, основанных на измерении веса амниона в зависимости от времени пропитывания лизатом БоТП, определено время 5 минут для максимального насыщения консервированной амниотической мембраны.
3. Лечение и профилактика ПЭР после кератопластик высокого риска с помощью покрытия роговицы лиофилизированной амниотической мембраной, насыщенной лизатом БоТП, приводит ускорению эпителизации в среднем на 38,7%, что обеспечивает условия для лучшего биологического эффекта его приживления и снижает частоту лизисов трансплантата на 50%.
4. Применение насыщенного факторами роста консервированного амниона у пациентов с ПЭР после свежих ожогов ускоряет эпителизацию на 27% (2 недели), снижает отёк роговицы по сравнению с обычным амнионом на 28% быстрее (на 54,7 мкм по данным ОКТ) и предупреждает рецидивы эрозии.
5. Использование насыщенного факторами роста консервированного амниона для лечения персистирующих язв роговицы ускоряет эпителизацию в среднем на 25% (на 12 дней) и способствует восстановлению толщины стромы роговицы на 49% (на 20,5 мкм) больше, чем обычный консервированный амнион.
Практические рекомендации
Основываясь на полученных результатах проведённого исследования, мы рекомендуем применение в клинической практике лиофилизированной амниотической мембраны, пропитанной в течение 5 минут лизатом аутологичной БоТП для лечения и профилактики ПЭР у пациентов после сквозных кератопластик высокого риска, свежих ожогов и при персистирующих язвах роговицы.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Биологический эффект комбинации лизата тромбоцитов и амниотической мембраны в культуре буккального эпителия / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А. [и др.] // Российский офтальмологический журнал. – 2022. – Т. 15. – №. 4. – С. 115-120.
2. Новый метод лечения персистирующих эрозий роговицы после кератопластики высокого риска / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А. [и др.] // Российский офтальмологический журнал. – 2023;16(3):94-99.
3. Применение нового способа лечения персистирующих дефектов роговицы различного генеза / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А. [и др.] // Российский офтальмологический журнал. – 2024;17(3):74-78.
4. Применение лизата тромбоцитов для увеличения ростстимулирующего эффекта амниотической мембраны in vitro / Боженко Д.А., Ченцова Е.В., Боровкова Н.В. [и др.] // Офтальмологические ведомости. – 2022. Т. 15. № 3. С. 57–62.
5. Предварительное клиническое исследование нового метода лечения ожоговых дефектов роговицы / Боженко Д.А., Е. В. Ченцова // Современные технологии в офтальмологии. – 2022. – № 3(43). – С. 62-65. –
6. Рост-стимулирующий эффект амниотической мембраны, насыщенной лизатом тромбоцитов / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А. [и др.] // XV Российский общенациональный офтальмологический форум. Сборник научных трудов. – 2022. – Т. 2. – С. 454-457.
7. Модифицированная мембрана «Флексамер» в лечении пациентов с замедленной эпителизацией после сквозной кератопластики / Боженко Д.А., Ченцова Е.В. // XVI Российский общенациональный офтальмологический форум. Сборник научных трудов. – 2023. – Т. 1. – С. 97-99.
8. Новый метод лечения свежих ожогов глаз насыщенной лиофилизированной амниотической мембраной / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А. [и др.] // XVII Российский общенациональный офтальмологический форум. Сборник научных трудов. – 2024. – Т. 2. – С. 396-399.
9. Патент РФ на изобретение № 2782129 от 31.03.2022. Способ хирургического лечения дефектов роговицы различного генеза. Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Боженко Д.А., Пономарев И.Н., Макаров П.В., Макаров М.С., Сторожева М.В. Москва, Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
Список сокращений
АМ – амниотическая мембрана
БоТП – богатая тромбоцитами плазма
OКT – оптическая когерентная томография
ПДР – персистирующий дефект роговицы
ПЭР – персистирующая эрозия роговицы
СКП – сквозная кератопластика
