Онлайн доклады

Онлайн доклады

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Все видео...

Сравнительные аспекты биологической активности проангиогенных пептидов регуляторов ангиогенеза VEGF и ?-FGF



ГУ «РОНЦ им. Блохина Н. Н. РАМН», ЦКБ РАН, ИБХ РАН, г. Москва
  
   Все современные антиангиогенные препараты, используемые в офтальмологии, направлены на блокирование фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF). Однако опыт показывает, что эти препараты оказывают неполноценный и кратковременный эффект. Одной из причин их низкой эффективности является недооценка роли избыточной продукции других проангиогенных пептидов.
  
  Цель — изучение сравнительной активности двух ключевых пептидов стимуляторов ангиогенеза: VEGF и фибробластного фактора роста — bFGF.
  
  Материал и методы. Проведен сравнительный анализ биологических эффектов in vitro и in vivo рекомбинантных пептидов VEGF165 и bFGF, предоставленных ИБХ РАН. Исследования выполнены на базе лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО (доктор мед наук. наук, ведущий научный сотрудник Степанова Е . В)
  Определение сравнительного проангиогенного потенциала веществ in vitro проводили с использованием культуры эндотелиальных клеток (ЭК) мыши (SVEC-4-10). Использовали стандартные наборы тестов для оценки влияния исследуемых веществ на ключевые параметры ангиогенеза (bFGF- и V EGFзависимая пролиферация и миграция ЭК, образование капилляроподобных структур). Методы позволяли адекватно оценить влияние пептидов на этапы ангиогенеза и сопоставить их биологические эффекты, а также концентрации, необходимые для развития идентичного по амплитуде биологического эффекта.
  Клетки SVEC-4-10 высаживали в низкой плотности (6 т клеток/мл) в триплетах на 48-луночный планшет в среде, содержащей 10 % сыворотки FCS. Среда, антибиотки и препараты менялись раз в 3–4 дня. Рост клеток определялся модифицированным «митогенным методом по Crystal Violet».
  Клетки промывались PBS и фиксировались 1 % парафармальдегидом на PBS и окрашивались 0,5 % раствором Crystal Violet (Sigma Chemical Co) на этаноле. Краситель растворяли в этаноле и измеряли на спектрофотометре при 540–560 нм. Миграционная активность культивируемых ЭК мыши SVEC-4-10 анализировали модифицированным методом «раневой поверхности». Клетки (500 т/мл) высаживали в специальных камерах в 24-луночный планшет в среде ДMEM содержащей 10 % сыворотки FCS и 2 мМ глутамина, и инкубировали до образования монослоя. Затем камеры удалялись, лунки промывались раствором PBS. В течение 24 часов ЭК инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 2мМ глутамина. В качестве положительного контроля использовались ЭК, инкубировавшиеся в ДМЕМ с добавлением 10 % FCS. Клетки докрашивали реактивом Лейшмана. Результаты оценивали как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина).
  Образование трубочко-подобных структур ЭК SVEC-4-10 анализировали следующим образом.
  24-луночную плашку покрывали раствором Матригеля и инкубировали 20 минут при 37 °С до полимеризации. Затем клетки наносили в лунки, покрытые Матригелем, и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 4–5 часов. В качестве положительного контроля использовали ЭК, инкубировавшиеся в среде ДМЕМ без добавления препарата. Оценивали длину трубочек и количество контактов между трубочками.
  Метод имплантата Матригеля был выполнен по стандарту [Passaniti A., 1992]. Аликвоты (700 мл) Матригеля (BD Biosciences), содержащие гепарин 60 У. Е ./мл, VEGF165 (100 или 50 нг/мл) были приготовлены на льду. В качестве отрицательного контроля использовали введение Матригеля, содержащего гепарин 60 У. Е ./мл, положительного контроля — Матригель, с аналогичным содержанием гепарина и bFGF. Инъекцию Матригеля проводили подкожно, абдоминально мышам-самкам BDA. После инъекции Матригель быстро образовывал одиночный, плотный гелеобразный имплантат. Через 7 дней после введения Матригеля мышей выводили из эксперимента путем передозировки эфира. Имплантаты были удалены, фиксированы в 10 % нейтральном формалине и заключены в парафин для гистологического исследования. Гистологические исследования проводили, окрашивая имплантант гематоксилином и эозином.
  Проводили иммуногистохимические исследования срезов Матригеля с антителами против CD34.
  
  Результаты и обсуждение. Установлено, что оба проангиогенных пептида VEGF165 и b-FGF дозозависимо стимулировали пролиферацию ЭК SVEC4-10 (табл.). Однако биологический эффект bFGF был достоверно выше и проявлялся при меньшей концентрации пептида в среде для культивирования (р=0,001). Пятикратное повышение концентрации VEGF незначительно (123 %) повышало пролиферацию ЭК. Аналогичное увеличение содержания bFGF сопровождалось более значимым (180 %) биологическим эффектом стимуляции пролиферации ЭК.
  Для того, чтобы получить аналогичный биологический эффект (180 % стимуляцию) необходима концентрация VEGF165 примерно на уровне 7000 нг/мл.
  Оценка влияния VEGF165 и bFGF на миграцию ЭК SVEC-4-10 с помощью модифицированного метода «заживления раны» показала, что оба тестируемых пептида стимулировали миграцию ЭК.
  10 % FCS увеличивал миграцию клеток SVEC-4-10 на 145 %, добавление bFGF 50 нг/мл — на 139 %, а V EGF165 100 нг/мл — на 122 % по сравнению с отрицательным контролем. Таким образом, биологическая активность bFGF по стимуляции миграции ЭК в 3,5 раза выше, чем аналогический показатель VEGF. Для достижения сопоставимого эффекта bFGF необходимо добавить 400 нг/мл VEGF.
  Не обнаружено значимого влияния VEGF165 и bFGF на формирование трубочко-подобных структур в среде in vitro. Известно, что биологические эффекты многих факторов роста, включая пептидырегуляторы ангиогенеза, проявляются in vitro и не выявляются или выявляются в другой манере in vivo.
  В связи с этим, мы провели дополнительную серию экспериментов для проверки и сопоставления эффектов VEGF и bFGF in vivo. В частности, была выполнена индукция роста новых кровеносных сосудов в имплантате Матригеля in vivo. При введении Матригеля без стимуляторов ангиогенеза на гистологических срезах имплантата наблюдаются только единичные ЭК. VEGF165 и bFGF значимо увеличивали миграцию клеток и формирование кровеносных сосудов в имплантате Матригеля. VEGF165 (800 нг/мл) стимулировал миграцию ЭК в Матригель. Мигрировавшие ЭК обнаруживались не только по периферии, но и в центре. Хотя образование зрелых кровеносных сосудов было плохо выражено, в имплантанте наблюдали эритроциты. Более 50 % клеток окрашивались АТ к CD34. Добавление в Матригель bFGF (100 нг/мл) также стимулировало миграцию ЭК в центр. Формировалось значительное количество микрососудов, содержащих эритроциты (4–5 в поле зрения). Количество мигрирующих ЭК (CD34-положительных) превышало 80 %.
  
  Выводы. Результаты экспериментальных исследований доказывают, что биологическая активность bFGF по стимуляции пролиферации и миграции ЭК, образованию сосудов in vivo в 5–1,5-3,5 раза выше, чем аналогический показатель VEGF. Блокирование эффектов только VEGF не способно подавить ангиогенез в целом. Возможны обходные пути стимуляции.
  


Страница источника: 522

Просмотров: 609