Online трансляция


ХVII Ежегодный конгресс
Российского глаукомного общества

Место проведения: отель «Холидей Инн Сокольники» г. Москва ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества

Трансляция проводится из четырех залов:
6 декабря - «Сокольники 2»
7 декабря - «Сокольники 1»
6,7 декабря - «Крымский вал»
6,7 декабря - «Охотный ряд»

Партнеры


Optec Ziemer Bausch + Lomb thea Allergan santen sentiss ОптоСистемы NIDEK
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.713-004.1-085

Антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF на экспериментальной модели васкуляризации роговицы по результатам морфологических исследований


1Центральная клиническая больница Российской академии наук
2Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Известно, что патологический ангиогенез может быть подавлен не только путем блокирования биологических эффектов стимуляторов ангиогенеза, но и путем усиления его природных ингибиторов. Многообещающие средства от рака, эндостатин и ангиостатин, открытые Джудой Фолкменом и его коллегами, породившие бурю оптимизма, из-за низкой эффективности в качестве противораковых препаратов были со временем незаслуженно забыты. Между тем, современные публикации свидетельствуют о возможности применения природных ингибиторов ангиогенеза при заболеваниях глаз, сопровождающихся неоваскуляризацией. В связи с чем мы провели серию экспериментальных исследований, направленных на изучение этой проблемы. В исследованиях in vitro и in vivo (клинически) был выявлен ангиостатический эффект 3-х тестируемых природных ингибиторов: эндостатина, тумстатина и фактора, выделенного из пигментного эпителия сетчатки — PEDF [2].

Цель

Изучить морфологически на световом уровне антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF.

Материал и методы

Изучали с помощью морфологических методов исследований антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF. Пептиды целевого назначения были созданы с помощью биотехнологии генной инженерии (лаборатория биотехнологий ИБХ РАН, зав. лаб. — акад. Мирошников А.И.) [2].

Биологическую активность тестируемых пептидов изучали in vivo на моделях заболеваний глаза, протекающих с ангиогенезом. Модель ангиогенеза формировали путем прошивания роговицы с лимба викриловыми швами (8-0) [1, 4]. При выборе экспериментальной модели ангиогенеза ориентировались на простоту воспроизведения, доступность визуального контроля ангиогенеза и гистогенетическую приближенность к существующим в природе неоваскулярным заболеваниям переднего отрезка глаза [1, 3].

После обездвиживания животного 1% раствором ксилы и инстилляционной местной анестезии 1% раствором дикаина на глаз накладывали векорасширитель. Модель формировали на двух глазах 6 кроликов (12 глаз) породы шиншилл (половозрелые самцы, вес — 2,5-3 кг). В качестве контроля служили правые глаза животных (6 глаз), опытным был левый глаз (6 глаз). Начиная с первого дня (день прошивания роговицы) эксперимента ежедневно под конъюнктиву в рекомендуемых концентрациях (7,2 нМ PEDF, 70,2 нМ эндостатина, 70,2 нМ тумстатина) вводили один из антиангиогенных пептидов в указанной концентрации. Делали по 10 субконъюнктивальных инъекций в каждый опытный глаз.

Животных в эксперименте лечили в полном соответствии с Резолюцией ARVO «По использованию животных в экспериментальных исследованиях», Принципами лечения лабораторных животных (публикация № 86-23 в NIH от 1985 г.) и ныне действующими правилами GMP (Good Medical Practice) [4].

Всех животных выводили из эксперимента на 15 сутки. Их глаза были энуклеированы и фиксированы в 10% нейтральном формалине. Из целого фиксированного глаза готовили центральную колодку, проходящую через центр роговицы, которую в дальнейшем заливали в парафин и готовили срезы (толщиной 3-5 мкм). Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону. Окрашенные препараты исследовали на световом «Фотомикроскопе-Ш» (Орton, Германия). С каждого глаза (n=12) готовили по 16 срезов роговицы (по 3 среза в 4 квадрантах), 16 срезов радужки (по 3 среза в 4 квадрантах) и 16 срезов хориоидеи (по 3 среза в 4 квадрантах). Всего было проанализировано морфологически на световом уровне 576 срезов.

Ангиостатический эффект тестируемых пептидов оценивали морфологическим, иммуногистохимическим, морфометрическим и колориметрическим методами.

Морфометрический анализ заключался в сравнительном изучении характера патоморфических изменений тканей глаза на фоне проводимого эксперимента, в подсчитывании количества новообразованных сосудов, врастающих в роговицу по ходу швов с лимба, и общей площади их просвета. Параллельно анализировали площадь распространения клеточного инфильтрата и состав клеток вокруг измеряемого сосуда. Расчеты проводили на участке роговицы, непосредственно прилежащей к швам и потому отличавшейся наибольшей выраженностью процесса.

Иммуногистохимические исследования (ИГХ) заключались в количественной оценке экспрессии маркера эндотелиальных клеток (ЭК) CD31 в тканях глаза. ИГХ проводили следующим образом. Парафиновые срезы депарафинизировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» АГ проводили» в течение 45 мин., используя водяную баню с цитратным буфером, нагретым до 95-99°С. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. и в фосфатном буфере — в течение 5 мин. Эндогенную пероксидазу блокировали 20-минутной инкубацией в темноте с 3% перекисью водорода, после чего промывали срезы в фосфатном буфере. Инкубацию с первичными АТ проводили при комнатной температуре в течение 40 мин. После первичных АТ стекла промывали 2 раза по 5 мин. в фосфатном буфере. Инкубация с АТ, меченными стрептавидином [LSAB®+ kit, DAKO], проводили при комнатной температуре в течение 20 мин., затем срезы промывали 3 раза по 5 мин. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB + систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 2-х мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Негативным контролем служила ИГХ реакция без добавления первичных АТ.

Оценку результатов ИГХ проводили на световом микроскопе «Аxiolab» E-re (фирма-производитель «Carl Zeiss», Германия). Использовали увеличение х400. Анализировали локализацию маркера и характер окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Применяли следующие критерии оценки иммуногистохимической реакции:

• отрицательной считали реакцию при отсутствии специфического окрашивания клеток;

• положительной реакцией считали наличие в препарате специфически окрашенных клеток.

Колориметрический анализ заключался в специальном техническом приеме, который применяли для подсчета индекса васкуляризации.

Методика подсчета индекса васкуляризации.

1. Производилась серия снимков различных участков среза лимбороговичной ткани, проходящей вокруг шва.

2. С помощью программы Photoshop (инструмент «овальная область») выделяли пиксели, составляющие изображение просвета сосудов в срезе (рис. 1а, б) и подсчитывали их количество (данные внесены в табл. 1 в столбце количество пикселей сосудов).

3. Затем полученная цифра делилась на общее количество пикселей изображения, таким образом получали показатель, именуемый далее как индекс васкуляризации для участка гистологического препарата, отображенного на снимке. Результаты представляли собой промежуточные индексы васкуляризации.

4. Для нахождения индекса васкуляризации всего препарата, мы находили среднее арифметическое из всех промежуточных индексов васкуляризации на каждом глазу.

Статистический анализ проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, SPSS. Линейные величины сравнивали по методу Стьюдента, при малой выборке использовали точный двусторонний тест Фишера. Достоверным считали отличие при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Было установлено морфологически на световом уровне, что все 3 препарата обладают сопоставимыми антиангиогенными эффектами.

Это проявляется достоверным снижением количества новообразованных сосудов на единицу площади тканевого среза в зоне просмотра по результатам морфометрических исследований, соответственно (р<0,001) (табл. 1). При этом колориметрические показатели суммарного просвета сосудов на срезе в пикселях достоверно снижаются (р<0,001), как и индекс васкуляризации лимбо-роговичной зоны (р<0,001).

Тумстатин и PEDF обладают более мощным антиангиогенным эффектом. Эндостатин по степени выраженности биологических эффектов значительно уступает им.

При исследовании роговицы методом световой микроскопии обращала на себя внимание различная степень выраженности отека (плотность и глубина распространения) и клеточной инфильтрации роговицы вокруг экспериментальных швов. Инфильтрат преимущественно состоял из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов.

Сравнительные аспекты количественной оценки противоотечного и противовоспалительного эффекта антиангиогенных препаратов продемонстрировали преимущества эндостатина (рис. 2а, б) перед двумя другими пептидами тумстатином (рис. 3а, б) и PEDF (рис. 4а, б). Все 3 препарата достоверно снижали количество клеточных элементов в инфильтрате, развившемся вокруг викриловых швов (табл. 2).

Однако доля эозинофилов в инфильтрате, развившемся вокруг шва на фоне эндостатина, была достоверно выше, чем на фоне применения тумстатина и PEDF. Более того, меньшая доля эозинофилов в инфильтрате, развившемся вокруг шва на фоне PEDF, свидетельствовала о возможном десенсибилизирующем / противоаллергическом / противовоспалительном потенциале этого пептида.

Из других патоморфологических изменений были отмечены следующие. Собственно эндотелий роговицы был дистрофически изменен во всех исследуемых опытных и контрольных глазах. Во всех исследуемых глазах обнаружены передние синехии в области экспериментальных дефектов. Они объяснялись перифокальным воспалением, которое возникало вокруг викриловых швов, проходящих насквозь роговицы, и контактирующих с тканями передней камеры глаза.

На светооптическом уровне токсического влияния исследуемых препаратов на эндотелий нормальных сосудов радужки и хориоидеи не обнаружено.

На первый взгляд, иммуногистохимические исследования с маркером CD31 казались неинформативными и непригодными для наших целей. Положительная ИГХ-реакция была обнаружена в эндотелии собственных сосудов радужной оболочки, в то время как в новообразованных сосудах в грануляционной ткани вокруг искусственных дефектов роговицы ИГХ-реакция на маркер CD31 оказалась отрицательной.

В связи с этим можно было предположить, что экспрессия CD31 начинается не сразу с момента образования сосудов, а несколько отсрочено в процессе во времени — к этапу их созревания. Это делает ИГХ-реакцию с маркером CD31 неприменимой для подсчета индекса васкуляризации в нашем эксперименте. Зато полученную негативную реакцию можно было расценивать как факт развития неполноценных новообразованных сосудов, не содержащих слоя эндотелиальных клеток в стенке. В этом, по-видимому, и проявлялся один из антиангиогенных эффектов используемых ингибиторов ангиогенеза.

В целом морфологические исследования подтверждали эффективность тестируемых ингибиторов ангиогенеза на ранних стадиях неоангиогенеза. (Ангиостатические пептиды вводились в эксперименте одновременно с индукторами ангиогенеза.) Вместе с тем, утверждать, что они будут эффективны и на поздних стадиях этого процесса, нельзя. Их пригодность в качестве аваскулогенных препаратов должна быть подтверждена в других моделях ангиогенеза, на более поздних его стадиях, в частности, на зрелых уже сформированных сосудах.

Выводы

1. Проведенные морфологические исследования позволяли утверждать, что все 3 тестируемые пептиды обладают заявленными ангиостатическими свойствами, что проявляется уменьшением интенсивности ангиогенеза в ответ на его индукцию викриловыми швами: достоверно снижается количество новообразованных сосудов на единицу площади ткани, а также уменьшается суммарный индекс васкуляризации на срезе.

2. Отсутствие ЭК в стенке новообразованных сосудов позволяет высказать предположение, что к антиангиогенным эффектам пептидов следует также отнести торможение миграции и пролиферации ЭК и/или усиление апоптоза ЭК. Негативная ИГХ-реакция с маркером ЭКCD31 новообразованных сосудов на фоне CD31-позитивной реакции ЭК сосудов радужной оболочки — подтверждает этот вывод.

3. Наряду с антиангиогенной активностью тестируемые пептиды обладали противоотечными и антипролиферативными эффектами, проявляющимися в уменьшении количества клеточных элементов вокруг викрилового шва и сокращении площади клеточной инфильтрации.

Экспериментальные исследования, представленные в статье, проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (ГК № 02.740.11.0717).


Страница источника: 65


Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференцияПироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практ...

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании...

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3DСложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеоси...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракци...

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

Top.Mail.Ru


Open Archives