Электронная микроскопия роговичной стромы после стандартного кросслинкинга и с применением фемтолазера в эксперименте

     Кератоконус является прогрессирующей, двусторонней, часто асимметричной, невоспалительной эктазией роговицы [15, 16, 20]. Распространенность кератоконуса в общей популяции составляет 1:2000 и обычно он диагностируется в течение второго и третьего десятилетия жизни [7]. Имеющиеся в настоящее время методы лечения кератоконуса (жесткие контактные линзы, послойная кератопластика, интрастромальные сегменты и кольца) в основном представляют собой вмешательства, имеющие тектоническую, оптическую либо рефракционную цель [1, 4, 5, 6, 10, 14, 21]. К сожалению, ни один из этих методов не является патогенетическим и не способен влиять на механизмы развития заболевания.

    Кросслинкинг роговичного коллагена (КРК) является методом биохимического ремоделирования роговицы и основан на совместном использовании фотосенсибилизатора рибофлавина и УФ-света длиной волны 370 нм, который был предложен в 2003 г. доктором Волензаком с соавт. [22-24, 27, 28]. КРК является единственным методом лечения, направленным на биомеханическую и структурную стабилизацию в кератоконусной роговице, что предотвращает прогрессирование эктазии [8]. КРК вызывает образование в коллагене ковалентных меж- и интрафибриллярных сшивок, которые повышают биомеханические свойства человеческой роговицы примерно на 300% [27]. «Сшивающий» эффект максимален только в передней строме [25].

     Хотя КРК зарекомендовал себя в клинической практике, по-прежнему предпринимаются усилия для изменения стандартного протокола, чтобы повысить безопасность и комфорт пациентов [13]. Широко распространенный Цюрихский протокол для КРК включает удаление эпителия роговицы для облегчения проникновения рибофлавина в строму [28].

    Однако деэпителизация сопровождается болью, ощущением инородного тела, дискомфортом в виде жжения и слезотечения в течение нескольких дней. Кроме того, при удалении эпителия уменьшается общая толщина роговицы, а последующее проведение КРК на роговице толщиной менее 400 мкм может быть причиной рубцов роговой оболочки, повреждения эндотелия и даже перфорации [11, 17, 18].

     Поэтому исследователи и клиницисты в настоящее время заинтересованы в разработке варианта КРК с максимальным сохранением эпителиального слоя при сохранении эффективности стандартного подхода. Одним из перспективных направлений является технология УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы, показавшая снижение степени выраженности и продолжительности послеоперационного дискомфорта пациента за счет ускоренной эпителизации роговицы по сравнению с классической технологией [3]. Также известна методика трансэпителиального кросслинкинга, при которой перед закапыванием рибофлавина для разрыхления эпителия роговицы инстиллируют сначала раствор тетракаина в течение 30 минут [9, 12, 19]. Однако при применении данной методики достигается только одна пятая часть биомеханического эффекта [26].

    На фоне этого разработанная нами методика роговичного кросслинкинга без удаления эпителия с фемтосекундным формированием интрастромального кармана для введения 0,1% раствора рибофлавина с последующим ультрафиолетовым облучением выглядит не менее актуальной [2]. Представляет интерес изучение изменений ультраструктуры стромы роговицы в различные сроки после проведения стандартного КРК и фемтокроссликинга для подтверждения эффективности новой методики.

    Цель

     Изучение и сравнение структуры тканей роговицы после стандартного КРК и фемтокросслинкинга в эксперименте.

    Материал и методы

    В работе использовали самцов кроликов породы Шиншилла массой 2-3 кг. Исследования выполняли на 18 глазах 9 кроликов. Животные были разделены на 3 группы:

    1. Опытная группа – кролики, которым проводилась процедура кросслинкинга с применением фемтолазера [2].

    2. Группа сравнения – кролики, которым проводилась процедура стандартного кросслинкинга по Цюрихскому протоколу [28].

    3. Контрольная группа – кролики, которым проводилось только фемтолазерное формирование кармана без процедуры кросслинкинга.

    Срок наблюдения составил 1 неделю, 1 и 3 мес.

    Процедура проводилась под общей (в/м 5% раствор кетамина) и местной (инстилляция 0,3% раствора инокаина) анестезией. Животным 1 группы под местной анестезией выполняли процедуру фемтокросслинкинга с помощью фемтосекундного лазера IntraLaseFS 60 кГц (Advanced Medical Optics) (рис. 1). Для этого на заданной глубине (100-110 мкм) формировали карман диаметром 9,0 мм, углом вреза 45 градусов, углом петли 45 градусов. В сформированный таким образом карман с помощью тупоконечной канюли вводили 0,1% раствор рибофлавина до полного и равномерного пропитывания стромы. Затем проводили облучение ультрафиолетовым светом плотностью мощности 3,0 мW/см² в течение 30 минут.

    Кроликам 2 группы производилось механическое удаление эпителия роговицы диаметром 9 мм, затем инстилляция 0,1% раствора рибофлавина в течение 15 минут. Облучение роговицы ультрафиолетом (3,0 мW/см² в течение 30 мин.) в обеих группах осуществляли с помощью аппарата EVOLUTION (ООО «Трансконтакт», Россия) (рис. 2).

    В 3 группе животным проводили только процедуру формирования роговичного кармана на заданной глубине (100-110 мкм) и диаметром 9,0 мм с углом вреза 45 градусов, углом петли 45 градусов с помощью фемтосекундного лазера – IntraLasе FS 60 (рис. 3).

    На сроках 1 неделя, 1 и 3 мес. кроликов выводили из эксперимента воздушной эмболией, глаза энуклеировали, роговицы вырезали с помощью трепана 9,0 мм. Выкроенные роговицы фиксировали в растворе глютаральдегида на фосфатном буфере в течение 24 часов, далее фиксировали осмием и готовили препараты для электронной микроскопии. Гистоморфологические исследования делали на трансмиссионном электронном микроскопе JЕOL 1200 EX (Япония) на базе Института биотехнологии РАН (г. Москва).

    Результаты и обсуждение

     Результаты проведенных электронно-микроскопических исследований показали, что через неделю после операции у животных 1 группы сразу под эпителием идет формирование продольных и поперечных сшивок коллагена, которые сконцентрированы вблизи базальной мембраны эпителия (рис. 4).

    К 1 мес. после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера сшивки коллагена в основном представлены в поверхностных слоях стромы (рис. 5).

    На сроке 3 мес. после процедуры сформированные сшивки сохраняются, вероятно, без влияния на них процессов ремоделирования (рис. 6).

    При большем увеличении в поверхностных слоях стромы определяются пласты сшитых волокон и пучков коллагена (рис. 7). Часть волокон сшито бок в бок, другая часть – конец в конец. На всех сроках наблюдения на препаратах 1 группы не обнаруживали явлений воспаления либо других осложнений.

    Во второй группе эпителизация роговицы происходила быстро, и через 1 неделю после стандартной процедуры кросслинкинга визуализируются отечные базальные клетки эпителия с признаками полиморфизма и увеличенными межклеточными пространствами, а также базальная мембрана с выраженными полудесмосомами. Это, по нашему мнению, свидетельствует о травматичности этапа удаления эпителия. В подлежащей строме видны участки поперечно сшитых коллагеновых волокон и фибрилл (рис. 8).

    Через 1 мес. после стандартной процедуры кросслинкинга базальная мембрана плотная, в поверхностных слоях стромы роговой оболочки коллагеновые волокна и фибриллы сшиты бок в бок и конец в конец. Волокна коллагена выглядят хаотически уложенными. Межуточное вещество сжато, волокна плотно соприкасаются друг с другом (рис. 9).

    Через 3 мес. в роговице животных 2-й группы волокна коллагена в продольном и поперечном направлении остаются сшитыми (рис. 10).

    Анализ микроснимков трансмиссионной электронной микроскопии после фемтокросслинкинга и стандартного КРК на всех сроках наблюдения показал одинаковое количество сшивок волокон коллагена, что можно расценить как равноценную эффективность обеих методик.

     В роговицах кроликов контрольной группы заживление эпителия и роговичной стромы на всех сроках после фемтолазерного формирования кармана, без последующей процедуры кросслинкинга, проходило без каких-либо особенностей. А именно через 1 неделю в зоне фемтолазерного формирования кармана определяются некротические отложения в строме между коллагеновыми фибриллами, вызванные деструктивными изменениями после воздействия фемтосекундного лазера. Изменений эпителия и субэпителиального слоя над стромальным карманом не визуализируются. Через 1 мес. после фемтолазерного формирования кармана эпителий и субэпителиальный слой, а также ход волокон в зоне формирования кармана не изменены, определяются единичные кератобласты (рис. 11).

    Заключение

    Исследование состояния ультраструктуры коллагена стромы роговицы экспериментальных животных выявило сопоставимые изменения в группах стандартного КРК и фемтокросслинкинга.

     Выявленные изменения в базальной мембране после стандартного КРК свидетельствуют о травматичности этапа удаления эпителия в отличие от методики КРК с введением рибофлавина в стромальный карман сформированный фемтолазером, которая является более безопасной для клинического применения.

    

    Поступила 13.08.2014

    

    Сведения об авторах:

    Паштаев Николай Петрович, докт. мед. наук, профессор, директор Чебоксарского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России;

    Поздеева Надежда Александровна, докт. мед. наук, зам. директора по научн. работе;

    Зотов Вадим Валерьевич, врач-офтальмолог

    Чебоксарский филиал ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

    Ларионов Евгений Викторович, ведущ. научн. сотрудник, ген. директор ООО «НПК Витаформ»

    Анисимов Сергей Игоревич, докт. мед. наук, профессор, научн. директор ООО « Восток-Прозрение»