Митохондриально-адресованные антиоксиданты как действующие вещества перспективных лекарственных препаратов

    Митохондриально-адресованные антиоксиданты как действующие вещества перспективных лекарственных препаратов

     Скулачев М.В.

    Митохондрии – это энергетические станции клетки. Однако вместе с полезной энергией они производят и вредные вещества – супероксид-радикалы, которые принимают участие в патогенезе практически всех болезней, связанных с апоптозом и гибелью клеток. Продукция свободных радикалов растет с возрастом, усиливаясь в критических состояниях, например, при ишемии, воспалении и в других стрессовых ситуациях. При этом в организме активируются эндогенные антиоксидантные системы, которые и обеспечивают нас стрессоустойчивостью, но если их действия недостаточно, то гибнут сначала сами митохондрии, а затем и клетки.

    Известные антиоксиданты – аскорбиновая кислота, таурин, эмоксипин, витамин Е, коэнзим Q10 – могли бы помочь организму защититься от окислительного стресса. Они прекрасно нейтрализуют свободные радикалы in vitro, но в организме действуют весьма слабо. Для классических антиоксидантов есть много ограничений, главным из которых является тот факт, что они не практически не попадают туда, где образуются супероксид-радикалы.

    Скулачеву В.П., академику РАН удалось придумать молекулу, лишенную этого недостатка. Она проникает непосредственно внутрь митохондрий. Эту молекулу американские ученые назвали ионом Скулачева. Академик предложил химически присоединить к ней один из самых мощных антиоксидантов – пластохинол из зеленых растений. Полученное вещество получило название SkQ1, и в 2011 году оно было зарегистрировано как фармакологическая субстанция (рис. 1). При этом ион Скулачева доставляет действующее вещество – остаток пластохинола - в митохондрии с точностью до нанометра, и, находясь в ней, этот антиоксидант нейтрализует свободные радикалы.

    Это вещество является жирорастворимым, липофильным и одновременно несет в себе заряд. Благодаря жирному компоненту это вещество крайне «мембранофильно» и накапливается именно в мембранах. Другие липофильные антиоксиданты, например коэнзим Q10, также хорошо проникает в мембраны, но при этом они практически полностью в остаются в тех мембранах, в которые попали первыми. Т.е. в мембране клетке или, в крайнем случае, во внешней мембране митохондрий. При этом образование свободных радикалов происходит именно во внутренних мембранах митохондрий. SkQ1 за счет заряженного компонента может перемещаться из мембраны в воду. Так как это вещество способно растворяться и в воде, оно проходит через цитоплазму клетки, переходя с одной мембраны на другую, и концентрируясь во внутренней мембране митохондрий, которая имеет огромный электрический заряд. Эта способность уникальна, и в итоге на внутренней поверхности мембран митохондрий концентрация вещества может оказаться вплоть до 200 миллионов раз больше, чем во внеклеточной среде (рис. 2). Немецкие ученые из университета г. Оснабрюк доказали возможность перехода SkQ1 из мембраны в мембрану через водную среду, а то, что вещество действительно накапливается в митохондриях, было показано еще ранее при помощи конфокальной флюоресцентной микроскопии (рис. 3).

     Первый эшелон защиты клетки против действия свободных радикалов представляет кардиолипин. Этот липид является компонентом внутренней мембраны митохондрий, и, окисляясь под действием супероксид радикалов, он разрушается, митохондрия погибает, что не дает распространяться дальше вредным продуктам перекисного окисления. Экспериментально доказано, что SkQ1 селективно защищает кардиолипин внутри мембраны митохондрий.

    При этом показано, что SkQ1 активно предотвращает окисление кардиолипина in vitro, прерывая цепную радикальную реакцию перекисного окисления липидов (рис. 4). Будучи окисленным, SkQ1 восстанавливается, «перезаряжаясь» дыхательной цепью митохондрий, что обеспечивает пролонгированность его действия. SkQ1 предотвращает окисление кардиолипина и в живых митохондриях. Доказан тот факт, что SkQ1 предотвращает гиперполяризацию митохондрий, тем самым снижая количество активных форм кислорода, производимых этими органеллами. За счет этого SkQ1 осуществляет профилактику воспалительных и дегенеративных процессов в различных тканях. Таким образом SkQ1 прерывает «порочный круг» окислительного стресса в митохондриях. После того как это было подтверждено в биохимических тестах, начались испытания на животных. Эксперимент, проведенный в Стокгольмском университете на ускоренно стареющих мышах-мутантах, показал, что SkQ1 увеличивает продолжительность их жизни и влияет на многие процессы старения в организме (рис. 5, 6). В других опытах прием животными SkQ1 предотвращал развитие многих глазных болезней: возрастного нарушения слезопродукции, катаракты, дегенерации сетчатки и глаукомы в моделях заболеваний. Эксперименты по моделированию синдрома сухого глаза на мышах проводились в Америке. Модель создавалась при помощи инъекций скополамина и помещения животных в поток сухого воздуха. Затем роговицу мышей окрашивали флуоресцеином и оценивали степень ее повреждения. В другом американском исследовании при помощи IL-1β и TNF-α индуцировалось воспаление в культуре человеческих клеток конъюнктивы. Было выявлено, что SkQ1 уменьшает степень повреждения роговицы мышей и снижает воспаление в культуре клеток конъюнктивы человека.

    В результате всех исследований были созданы глазные капли Визомитин. Клинические испытания Визомитина начались в 2009 году, а в декабре 2011 года препарат был зарегистрирован как лекарственное средство. В июле 2012 года препарат поступил в аптеки (рис. 7). Рекомендованная цена Визомитина в аптеке – 599 рублей. Одного флакона при двухразовом применении в сутки хватает примерно на 1 месяц. Он хорошо сочетается с другими лекарствами. Срок его хранения до 2 лет при температуре от 2 до 8 °С в темноте.

    Клинические испытания эффекта Визомитина при синдроме сухого глаза проводились в России, Украине и США. Трехнедельный курс применения Визомитина достоверно уменьшал количество жалоб пациентов по сравнению с другими препаратами, а также значительно ускорял заживление дефектов роговицы (рис. 8).

     Вторая фаза клинических исследований эффективности Визомитина проводилась в офтальмологическом центре ORA, штат Массачусетс, США. Это было двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование, в котором приняли участие 91 человек. Исследование проводилось следующим образом. В течение недели пациентам закапывали плацебо, на 7-й день оценивались результаты и исключали из испытаний пациентов с хорошим эффектом от плацебо. Далее роговицу пациентов подвергали действию САЕ – «модельной среды контролируемой агрессивности», т.е. действию потока сухого воздуха, что ухудшало состояние глаз. Далее в течение 4-х недель они закапывали один из трех препаратов – Визомитин, Визомитин-форте (содержащий в 10 раз больше SkQ1 чем обычный Визомитин) или плацебо, представляющее собой обычную искусственную слезу. На 29-й день они снова подвергались воздействию САЕ. Исключение на начальном этапе пациентов с хорошим эффектом от плацебо снижало разброс данных, а среда САЕ позволяла в какой-то степени уравнять степень повреждения роговицы, что делало результаты исследования более достоверными. Проводимое подобным образом испытание на 90 больных сопоставимо с исследованием на 1000 пациентах, так как выборка становится более однородной.

    Американские исследователи пришли к выводу, что поражение конъюнктивы и роговицы, а также выраженность жалоб после второй обработки САЕ было значительно менее выражено у пациентов, которые закапывали Визомитин по сравнению с группой плацебо. При этом разницы между Визомитином и Визомитином-форте выявлено не было, то есть концентрация действующего вещества в первом препарате оказалась достаточной для роговицы.

    Это исследование доказало безопасность препарата и его эффективность несмотря на достаточно жесткие условия эксперимента. Теперь, ознакомившись с результатами испытаний, FDA США готово выдать разрешение на проведение 3-й фазы клинических исследований.

    В еще одном отечественном исследовании Визомитин применяли у пациентов с выраженными симптомами сухости глаз, вызванными ношением контактных линз. Препарат применяли вечером несколько раз в течение часа после снятия контактных линз. При этом было подтверждено, что Визомитин ускоряет заживление дефектов роговицы. По данным другого инициативного исследования было выявлено, что закапывание Визомитина в процессе длительно проникающих операций с продолжительной общей анестезией снижает вероятность повреждения роговицы у этих больных.

     Визомитин – это препарат, который не просто восполняет недостаток слезы; он также улучшает состояние глаза с сохранением терапевтического эффекта в течение 2-4-х недель.

    Для мощного антиоксиданта существует еще одна достаточно ясная область применения. Это возрастная катаракта. Известно, что возрастное помутнение хрусталика связано с оксилительным повреждением его белков – кристаллинов. Исходя из этих предпосылок и, естественно, результатов доклинических испытаний, на базе НИИ ГБ РАМН Москвы и СПБГМА Санкт-Петербурга было проведено клиническое исследование эффективности Визомитина в лечении и профилактике катаракты. Курс применения препарата составлял 6 месяцев 3 раза в день. Были получены данные, что острота зрения у пациентов с начальной катарактой увеличивалась на фоне применения Визомитина (рис. 9). Особо яркий эффект наблюдался в группе пациентов старше 70 лет.

    В результате препарат получил новое, уже одобренное МЗ РФ показание к применению – начальная катаракта. Он имеет и другие перспективы расширения показаний – глаукома, возрастная дегенерация сетчатки и другие возраст-зависимые болезни. Клинические исследования по этим показаниям ведутся.

    Другим препаратом фирмы Митотех является Митовитан – интервенционная сыворотка, содержащая тот же антиоксидант SkQ1 и призванная прерывать процесс старения кожи.

    Также в 2015 г. стартовали клинические исследования препарата SkQ1 системного действия: раствора для приема внутрь «Пластомитин».

    

    Международное многоцентровое двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое исследование эффективности и безопасности препарата Визомитин у больных с синдромом сухого глаза

     Бржеский В.В.

    Синдром сухого глаза распространен во всех странах мира. Повышенная испаряемость слезной пленки при этом заболевании ведет к гиперосмолярности слезы, а это приводит к апоптозу клеток, воспалению и развитию мощных метаболических расстройств в эпителии. В результате нарушается рельеф поверхности роговицы, теряется гликокаликс, снижается тактильная чувствительность – и каждый из этих компонентов нуждается в активном восстановлении.

    Метаболическая терапия синдрома сухого глаза направлена на восстановление метаболизма в эпителии роговицы и конъюнктивы. Она должна способствовать нормализации функции добавочных слезных желез и бокаловидных клеток конъюнктивы, а также восстановлению чувствительной иннервации глазной поверхности.

    В исследовании клинической эффективности препарата Визомитин приняли участие 240 пациентов в 10 медицинских центрах России и Украины (120 больных закапывали Визомитин, 120 – плацебо). Плацебо представлял собой гипромелозу, то есть его состав был идентичен Визимитину, но без ионов SkQ1. Препарат использовали 3 раза в день в течение 6 недель. Пациентов обследовали на 8 визитах, период наблюдения составлял 12 недель. В исследование были включены пациенты от 18 до 75 лет с наличием клинических признаков сухого глаза 1 и 2 степени тяжести. Эффективность препарата оценивалась по результатам пробы Ширмера, пробы Норна, оценке повреждения роговицы при окрашивании флюоресцеином, остроте зрения и высоте слезного мениска. Для оценки безопасности препарата дополнительно проводились тонометрия, измерение АД и ЧСС, регистрация жалоб.

    При оценке переносимости препарата серьезных нежелательных явлений не было ни в одном случае. Легкие нежелательные явления преимущественно представляли собой преходящие ощущения рези, жжения или иного дискомфорта после закапывания препарата, связанные с проявлением синдрома сухого глаза. 2 случая аллергической реакции (в группе плацебо) привели к отмене препарата. Применение Визомитина не влияло на показатели АД, ЧСС, не приводило к повышению ВГД или ухудшению иных показателей. Средняя оценка переносимости препарата врачами и пациентами по шкале от 0 до 100 баллов составила около 90 баллов, что соответствует хорошей переносимости.

    Судя по данным пробы Ширмера Визомитин существенно не изменяет общую слезопродукцию по сравнению с контрольным препаратом. А вот данные пробы Норна свидетельствуют о том, что Визомитин обладает посттерапевтическим эффектом на стабильность прероговичной слезной пленки (рис. 10).

    Если исходные изменения роговицы были минимальными, то эффекта препарата на прокрашивание флюоресцеином мы, естественно, не видели, но при достаточно выраженном исходном повреждении роговицы на фоне применения Визомитина состояние глазной поверхности становилось значительно лучше. Визомитин достоверно улучшает эпителизацию роговицы в центральной зоне в подгруппе пациентов с исходным выраженным прокрашиванием роговицы (рис. 10).

    Визомитин эффективнее купировал субъективные симптомы сухости глазного яблока у больных с выраженным окрашиванием роговицы, чем со слабым ее окрашиванием.

    По итогам клинических испытаний глазные капли Визомитин являются безопасным препаратом для лечения синдрома сухого глаза, хорошо переносятся пациентами и не вызывают серьезных побочных реакций. Визомитин проявляет более выраженный стабильный лечебный и посттерапевтический эффект при лечении синдрома сухого глаза в сравнении с плацебо. Глазные капли Визомитин являются высокоэффективным средством, достоверно улучшающим эпителизацию роговицы и повышающим стабильность слезной пленки у пациентов с синдромом сухого глаза.

    

    Противовоспалительное и ранозаживляющее действие митохондриального антиоксиданта SkQ1

     Зиновкин Р.А.

    Для моделирования воспаления в нашей лаборатории мы воздействовали на культуру клеток эндотелия сосудов определенными воспалительными стимулами, используя либо компоненты патогенов (например, клеточные стенки различных микроорганизмов), либо провоспалительные цитокины, либо фрагменты разрушенных клеток организма. В ответ на взаимодействие воспалительного стимула со специфическими рецепторами в клетке активизируются воспалительные каскады. Один из них основан на действии специфических ферментов – киназ, а второй – на действии фактора NF-kB, который проникает из цитоплазмы в ядро, связывается с ДНК и запускает выработку цитокинов воспаления.

    Эндотелий сосудов играет важную роль в развитии воспаления. Под действием цитокинов воспаления, которые вырабатывают лейкоциты, эндотелиальные клетки активируются, и на их поверхности начинают синтезироваться специфические молекулы, называемые молекулами адгезии. Благодаря им лейкоциты прочно прикрепляются к поверхности эндотелия сосудов, потом лейкоциты разрушают межклеточные контакты в слое эндотелиальных клеток и проникают внутрь к очагу воспаления. Если этот процесс идет с избыточной интенсивностью, воспаление усиливается и становится хроническим. Кроме того, прикрепление макрофагов к поверхности эндотелия ведет к формированию атеросклеротических бляшек. Экспрессия молекул адгезии контролируется именно фактором NF-kB.

    Предварительные опыты на культуре клеток эндотелия сосудов in vitro показали, что SkQ1 предотвращает транслокацию NF-kB в ядра клеток (рис. 11). Современные технологии позволяют измерить количество молекул, и, используя такой подход, мы обнаружили, что SkQ1 снижает экспрессию молекул адгезии, а также адгезию лейкоцитов к эндотелию. Это доказывает, что SkQ1 обладает противовоспалительным действием.

    Мы проверили наши in vitro данные на животных, имеющих повышенный воспалительный фон, и выявили, что SKQ1 при пероральном применении снижает экспрессию молекул адгезии в аортах старых мышей до уровня молодых животных. Кроме того, гистологический анализ показал, что, действительно, их сосуды не претерпевали характерных возрастных изменений.

     Обработка эндотелия цитокинами воспаления ведет к разрушению межклеточных контактов даже без вмешательства лейкоцитов. При этом в стенке капилляров формируются бреши, через которые из кровотока в ткани могут проникать низко- и даже высокомолекулярные вещества. В результате в тканях формируется отек, что сопровождается болью. Нами было выявлено, что SkQ1 предотвращает разборку межклеточных контактов в слое эндотелиальных клеток, и это представляет собой второй аспект влияния SkQ1 на воспаление (рис. 12).

    На сегодняшний день выделяют две группы противовоспалительных препаратов. Это глюкокортикоиды, которые действуют через внутриклеточные рецепторы и обладают целым рядом побочных явлений, и нестероидные противовоспалительные средства, которые действуют через ингибирование циклооксигеназ.

    Наши опыты позволяют выделить новую группу противовоспалительных средств – митохондриально-направленные соединения SkQ1, которые уменьшают активацию воспалительных каскадов.

    В заживлении ран можно выделить несколько фаз: воспалительная фаза (опасно, если эта фаза затягивается), фаза пролиферации (образование грануляционной ткани, состоящей главным образом из макрофагов и фибробластов) и регенерация (ремоделинг тканей и эпителизация).

    Мы исследовали, как действует пероральный прием SkQ1 на заживление ран у лабораторных животных. Оказалось, что SkQ1 ускоряет эпителизацию ран у старых животных, и скорость заживления у них становится такой же, как и у молодых особей (рис. 13, 14).

    Нам стали известны некоторые детали, на которые влияет SkQ1 при заживлении. SkQ1 уменьшает количество нейтрофилов в ранах, то есть влияет на воспалительную фазу, а у старых животных затянута как раз именно эта фаза, и нейтрофилы присутствуют в ране гораздо дольше. Кроме того, SkQ1 ускоряет образование грануляционной ткани, и, следовательно, укорачивает стадию грануляции. Такие же данные были получены и у животных с диабетом.

    Подводя итог вышесказанному, можно отметить, что SkQ1 обладает противовоспалительным действием на эндотелий сосудов, уменьшая адгезию лейкоцитов и снижая проницаемость сосудистой стенки. SkQ1 ускоряет процесс заживления полнослойных кожных ран у старых и диабетических животных.

    

    Изучение распределения SkQ1 в глазах кроликов породы Шиншилла при местном применении

     Каргер Е.М.

    Известно, что большинство глазных капель не проникает в задний отрезок глаза. Учитывая уникальную способность SkQ1 проникать в клетки, а следовательно, и в ткани, оказалось целесообразным изучить, как распределяется это вещество в глазу при местном применении в виде инстилляций, и, тем самым, оценить перспективы его применения при оптических нейропатиях или ретинопатии.

    В исследовании на кроликах были использованы глазные капли с концентрацией SkQ1 15,5 мкг/мл, 4,65 мкг/мл и 1,55 мкг/мл, то есть 100-кратный, 30-кратный и 10-кратный Визомитин.

    В первом эксперименте, при закапывании 100-кратного Визомитина в режиме 3 раза в день в течение 2 недель была оценена его концентрация в роговице через 30 минут, 2.5, 5, 12 и 24 часа после последней инстилляции. Оказалось, что падение концентрации во времени соответствует одночастевой модели с временем полувыведения 8.25 часа. Это довольно длительный период для такой хорошо омываемой ткани как роговица.

    В следующем эксперименте оценивали зависимость накопления SkQ1 от его концентрации в глазных каплях. На этом этапе сравнивали 10-кратный Визомитин (Визомитин-ФОРТЕ), 30-кратный Визомитин и использовали данные, полученные при инстилляции 100-кратного Визомитина. Эта зависимость оказалась линейной. При этом SkQ1 был обнаружен не только в эпителии и строме роговицы, но и в слое эндотелия и десцеметовой оболочки, достигая там концентрации 2-2.5 раза меньше, чем в цельной роговице или в ее верхних слоях, что в дальнейшем дает возможность рассмотреть перспективы использования Визомитина в лечении эпителиально-эндотелиальной дистрофии роговицы.

    В заключительном эксперименте оценивали количество SkQ1 в тканях заднего отрезка глаза при закапывании 100-кратного Визомитина коротким курсом 4 раза в течение 24 часов и длительным курсом 3 раза в день в течение 2-х недель. Энуклеация производилась через 30 минут после последней инстилляции и через 2,5 часа.

    Оказалось, что при применении коротким курсом, среди тканей заднего отрезка глаза, SkQ1 обнаруживался только в хориоидее. При инстилляции длительным курсом и энуклеации через 30 минут после последнего закапывания SkQ1 обнаруживался в хориоидее и зрительном нерве, а при энуклеации спустя 2,5 часа после последней инстилляции SkQ1 был обнаружен и в тканях сетчатки.

    Учитывая, что зависимость концентрации SkQ1 в тканях от концентрации его в каплях линейная, логично предположить, что применение Визомитина-ФОРТЕ (10-кратного Визомитина) длительным курсом позволит достичь концентрации SkQ1 в роговице 9.6 нМ, в хориоидее – 0,7 нМ, в диске зрительного нерва 1,6 нМ, а в сетчатке – 0,59 нМ. При этом терапевтическая концентрация SkQ1 составляет от 0,2 до 20 нМ.

    Исходя из полученных данных, Визомитин-ФОРТЕ может быть эффективен при заболеваниях заднего отрезка глазного яблока. Планируется провести клиническое исследование по изучению применения этого препарата при возрастной макулярной дегенерации.