Первый опыт определения микробиоценоза глазной поверхности методом газовой хромато-масс-спектрометрии

    Актуальность

     Заболевания глазной поверхности занимают лидирующее место в структуре офтальмопатологии и имеют тенденцию к росту, что связано со многими факторами, в числе которых распространенность и контагиозность острых воспалительных заболеваний глаз, самолечение пациентов, неконтролируемое местное применение антибиотиков и гормональных препаратов, изменение экологии, условий труда и отдыха [1, 2, 4, 9].

    Этиология длительно текущих хронических заболеваний глазной поверхности часто остается неизвестной из-за низкой вероятности высева микробов из мазков, что связано с тем, что по существу организации микробной биопленки в мазках может содержаться лишь выведенный на поверхность с разложенным мукозом микробный дебрис или нежизнеспособные клетки [1, 3, 6]. Отсутствие объективного представления об этиологии заболевания ведет к назначению неэффективных лекарственных препаратов, длительному течению заболеваний и повышению риска развития осложнений [5, 7, 10]. В связи с этим остается актуальным вопрос о поиске высокоинформативного метода определения этиологии воспалительного процесса [3, 4, 7].

    Благодаря появлению метода детектирования микроорганизмов по нелетучим жирным кислотам клеточной стенки микроорганизмов методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС) – создается возможность качественно и количественно оценить микробиоценоз глазной поверхности и индивидуально подобрать эффективную этиологическую и патогенетическую терапию [3, 5-7, 14]. Метод основан на использовании больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов [3, 5, 7]. Метод ГХ-МС около 15 лет проходил апробацию в медицинских учреждениях Москвы и в 2010 г. его применение в качестве новой медицинской технологии было разрешено Росздравнадзором на территории Российской Федерации – «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (разрешение ФС от 24.02.2010 г. № 2010/038).

    Цель

    Оценить микробиоценоз отделяемого глаз методом ГХ-МС у пациентов с хроническими заболеваниями глазной поверхности.

    Материал и методы

    Был проведен анализ результатов исследования состава микробных маркеров в отделяемом глаз методом ГХ-МС у 50 пациентов с хроническими заболеваниями глазной поверхности, из них 22 мужчины и 28 женщин в возрасте от 20 до 78 лет (средний возраст 43,5±6,15 года), которые обратились в клинику с января по март 2016 г. Все пациенты ранее проходили курсы консервативного лечения воспалительных заболеваний глаз в других клиниках и не были удовлетворены результатами.

    Пациенты были разделены на 3 группы по основным клиническим проявлениям заболевания: в группу I вошли 20 пациентов с хроническим конъюнктивитом, в группу II вошли 24 пациента с хроническим блефароконъюнктивитом, в группу III вошли 6 пациентов с кератоконъюнктивитом. Всем пациентам было проведено офтальмологическое обследование, включающее визометрию, авторефрактометрию, бесконтактную тонометрию, переднюю и заднюю биомикроскопию, по показаниям проводилась проба Ширмера, флуоресцеиновая инстилляционная проба, диагностическое промывание слезных путей. Для исследования у каждого пациента осуществлялся забор отделяемого конъюнктивальной полости одного из глаз с более выраженными клиническими проявлениями заболевания при помощи стерильного зонда с ватным наконечником в пробирку без среды. Проводилось исследование материала методом ГХ-МС на наличие 57 микроорганизмов, концентрация которых определялась по молекулярным маркерам в лаборатории медицинского холдинга «СМ-Клиника».

    Результаты и обсуждение

    Микроорганизмы, выявленные в отделяемом глаз 50 обследованных пациентов с хроническими заболеваниями глазной поверхности, указаны в табл. Существенные (более чем в 2 раза) отклонения в численности колонизации претерпевают многие микроорганизмы – 27 из 57. Особенно часто увеличивается концентрация Staphylococcus aureus – в 49 из 50 глаз (98%), Streptomycess spp. – в 45 из 50 глаз (90%), Blautia coccoides – в 45 из 50 глаз (90%), Peptostreptococcus anaerobus – в 44 из 50 глаз (88%), Streptococcus mutans – 43 из 50 глаз (86%), Str.pneumonia – в 43 из 50 глаз (86%), Streptococcus spp. – в 31 из 50 глаз (62%), Clostridium perfringens – в 25 из 50 глаз (50%); из грибов и дрожжей – Aspergillus spp – в 19 из 50 глаз (38%), Candida spp. – в 9 из 50 глаз (18%). При этом в каждом анализе наблюдался существенный рост численности колонизации от 4 до 16 видов микроорганизмов.

    Однако основной тенденцией хронических заболеваний глазной поверхности является уменьшение численности большинства микроорганизмов – 34 из 57 контролируемых, более чем в 50% случаев, причем в каждом отдельном случае уменьшение составляло от 11 до 23 видов микроорганизмов. Отмечалось сокращение численности Eubacterium spp. в 50 из 50 глаз (100%), Bifidobacterium spp. в 50 из 50 глаз (100%), Lactobacillus spp. в 50 из 50 глаз (100%), микроорганизмов, относящихся к энтеробактериям, в 50 из 50 глаз (100%), Staphylococcus epidermidis в 45 из 50 глаз (90%), Prevotella spp. в 41 из 50 глаз (82%), а так же микроорганизмов, относящихся к аэробным актинобактериям Nocardia asteroids в 50 из 50 глаз (100%), Rodococcus spp. в 50 из 50 глаз (100%), Actinomyces spp в 45 из 50 глаз (90%), Actinomyces viscosus в 43 из 50 глаз (86%). Отсюда следует, что причиной хронических заболеваний глазной поверхности является не определенный инфекционный агент, а скорее неспецифические изменения нормальной микрофлоры конъюнктивы. Как видно из табл., при хроническом конъюнктивите, блефароконъюнктивите и кератоконъюнктивите наблюдаются схожие изменения. Большинство перечисленных микроорганизмов являются естественными обитателями глазной поверхности, поэтому в пределах чувствительности метода (в данном случае 10 5 кл/мл) фактически наблюдается изменение количественного состава микроорганизмов, колонизирующих в норме глазную поверхность, что является признаком дисбиоза [7, 10, 16].

    Случаи более чем двукратного превышения нормы (>2 N) численности микроорганизмов в отделяемом глаз и уменьшения их численности более чем вдвое (<0,5 N) были отмечены во всех трех исследуемых группах. Полученные данные свидетельствуют о дисбиозе при хроническом конъюнктивите, блефароконъюнктивите и кератоконъюнктивите, который отмечают в своих исследованиях и другие авторы [11-13, 15]. Во всех группах отмечался выраженный дефицит доминирующих представителей нормальной микрофлоры: Bifidobacterium spp., Eubacterium spp., Lactobacillus spp., Propionebacterium freudenreichii, что заставляет задуматься о целесообразности разработки препаратов, восстанавливающих нормальную микрофлору конъюнктивальной полости у пациентов, перенесших длительное лечение антибиотиками.

    Тактика дальнейшего лечения каждого пациента определялась индивидуально по результатам полученного анализа отделяемого одного из глаз, с учетом чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и фармакологических свойств лекарственных препаратов [8, 9]. Лечение все пациенты получали бинокулярно в связи с наличием схожих клинических проявлений заболевания на парном глазу. В 19 случаях из 50 потребовалась местная противогрибковая терапия в связи с выявленным клинически значимым превышением численности (более чем в 2 раза по сравнению с нормой) Candida spp. и Aspergillus spp.: 8 пациентов из группы I (40%), 9 пациентов из группы II (37,5%) и 2 пациента из группы III (33,3%). Подбор антибактериальной терапии осуществлялся, исходя из фармакологической активности лекарственных препаратов по отношению к выявленным микроорганизмам, и потребовался лишь в 18 случаях из 50 (36%). В 24 случаях из 50 (48%) применялись местно только антисептические препараты в связи с ростом малого числа патогенных микроорганизмов и их высокой чувствительнотью к антисептикам. А в 8 случаях из 50 (16%) противомикробной терапии не потребовалось – пациенты получали неспецифическое противовоспалительной лечение и слезозаместительную терапию, данные пациенты относились к группе I. Лечение пациентов с хроническими заболеваниями глазной поверхности, согласно полученным данным при анализе отделяемого глаза, было высокоэффективно во всех исследуемых группах, позволило достигнуть ремиссии у 42 пациентов (84% случаев).

    Заключение

    При хронических заболеваниях глазной поверхности состав микробиоты отличается от нормы: во всех исследуемых группах отмечается увеличение концентрация Streptococcus spp., Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Blautia coccoides, Str.pneumonia, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus anaerobus, Streptomycess spp., Aspergillus spp, Candida spp. и снижение концентрации Staphylococcus epidermidis, Bifidobacterium spp., Eubacterium spp., Lactobacillus spp., Prevotella spp., а также микроорганизмов, относящихся к аэробным актинобактериям и энтеробактериям. Количественный и качественный анализ микробиоценоза глазной поверхности методом ГХ-МС дает возможность выбора эффективных препаратов для консервативного лечения. Целесообразно дальнейшее исследование микробиоценоза глазной поверхности для получения статистически достоверных данных о закономерностях развития дисбиоза.