ис. 1. Изображения биоптата роговичного эпителия, не измененного какими-либо патологическими процессами, полученные на сканирующей электронной микроскопии (детектор BSE, лантаноидное контрастирование): а) со стороны передней поверхности; б) со стороны базальной поверхности
Рис. 2. Изображения биоптата роговичного эпителия при буллезной кератопатии, полученные на сканирующей электронной микроскопии (детектор BSE, лантаноидное контрастирование): а) со стороны передней поверхности (булла показана пунктирной линией); б)со стороны передней поверхности с большим увеличением; в) вид со стороны БМ.; г ) со стороны БМ с большим увеличением
Мы предположили, что для одновременной визуализации объемной структуры образца, расположения компонентов внеклеточного матрикса и локализации ряда Ca2+- и АТФ-зависимых процессов на молекулярном уровне может быть применим метод лантаноидного контрастирования с последующим проведением сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) [4]. Подобный подход позволит объективно оценить ультраструктуру комплекса клеточной адгезии при различных состояниях эпителия роговицы.
Цель
Изучить ультраструктуру комплекса клеточной адгезии роговичного эпителия в норме, при рецидивирующей эрозии и буллезной кератопатии при помощи нового метода визуализации – сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием.
Материал и методы
Исследовали соскобы переднего эпителия роговицы, полученные в условиях операционной, у больных, страдающих РЭР (9 образцов) или БК (4 образца), а также с кадаверных глаз без признаков офтальмологических заболеваний (5 образцов). Образцы были контрастированы с использованием набора реактивов «BioREE» (ООО Глаукон, Россия) по рекомендованному производителем протоколу. Подготовленные эпителиальные пласты расправляли поверх специализированной адгезивной углеродной ленты для СЭМ. Каждый образец размещали таким образом, чтобы доступными для наблюдения оказались одновременно и передняя поверхность эпителия, и базальный слой. Образцы размещали в камере сканирующего электронного микроскопа (EVO LS10, ZEISS, Германия). Наблюдения вели в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па) при ускоряющем напряжении 20–28 кВ и токе на образце 360–520 пА. Использовали катод LaB6. Изображения захватывали в режиме детекции обратно-рассеянных электронов (BSE).
Результаты и обсуждение
Контрастность изображений, получаемых на СЭМ в режиме детекции обратно-рассеянных электронов, определяется средним атомным весом вещества образца. При этом яркие участки изображения соответствуют насыщенным тяжелыми химическими элементами структурам. Метод суправитального лантаноидного контрастирования служит для избирательного насыщения «тяжелыми» лантаноидами отдельных структур и маркирования ими некоторых цепочек клеточного обмена. Новый метод визуализации позволил получить для разных состояний эпителиальной ткани (условная норма, БК и РЭР) значительно отличающиеся картины, характеризующие изменениями ее ультраструктуры. Повторяющиеся паттерны на СЭМ-изображениях с высокой долей вероятности отражают элементы, вовлеченные в однотипные патологические процессы.
СЭМ «нормального» эпителия роговицы
На сканограммах передней поверхности «нормального» роговичного эпителия контрастно выделяются границы между клетками, хорошо видна полигональная форма клеток десквамирующегося слоя (рис. 1а). Яркое свечение отдельных межклеточных границ указывает на зоны наибольшей концентрации кадгеринов и, таким образом, маркирует расположение десмосом, плотных и адгезионных контактов (указано стрелкой). Цитоплазма клеток умеренно замутнена, что говорит об активности протекавших в ней энергозависимых процессов с участием фосфат-аниона.
На базальной поверхности межклеточные контакты, содержащие кадгерин, светятся по всей протяженности границ клеток, что говорит о большей регулярности в их организации по отношению к переднему десквамирующемуся слою эпителия. Базальная поверхность клеточного пласта прикрыта отделившейся вместе с образцом мембраной, которая полупрозрачна для электронов (рис. 1б).
СЭМ эпителия роговицы при буллезной кератопатии
При буллезной кератопатии СЭМ-изображения эпителиального пласта со стороны передней поверхности демонстрируют сохранную архитектуру ткани на большей части площади образца. В зонах расположения булл, где повышенное давление привело к избыточному растяжению клеточного пласта, очертания клеток выглядят значительно ярче, наблюдается разобщенность клеток (рис. 2 а, б). На изображении с большим увеличением отчетливо видно двойственное строение зоны десмосомы (указано стрелками).
Базальный слой при БК, как правило, не перекрыт более плотными структурами. Межклеточные границы четкие, яркие (рис. 2в). Представляется логичным, что при соскабливании эпителия при БК он снимается в зонах булл, где произошло отслоение клеточного слоя от плотной пластинки [3].
СЭМ эпителия роговицы при рецидивирующей эрозии роговицы
При РЭР изменения в структуре роговичного эпителия были выявлены по всей поверхности. На изображениях видны характерные ландкартообразные и фестончатые границы клеток (рис. 3а, б). Отмечается повсеместная пятнистость поверхности, подчеркивающая неравномерность накопления Nd в ткани, что может быть обусловлено тем, что секрет, покрывающий поверхность клеток, разрежен ферментами [2]. Можно было наблюдать контрастированные ядра клеток в разреженной цитоплазме. На отдельных участках структура передней поверхности становится рыхлой, межклеточные контакты не визуализируются, а группы клеток образуют десквамирующиеся пласты. Участки, где под поверхностным слоем обнажается слой, расположенный глубже, демонстрируют, что подобные изменения практически не затрагивают средние слои – взаиморасположение клеток подлежащего слоя близко к нормальному.
Со стороны базального слоя отмечаются зоны с отсутствием контрастирования неодимом межклеточных границ. Как видно на изображении (рис. 3г), отделение эпителиального пласта от БМ при соскабливании происходит преимущественно без плотной ее части, хотя в некоторых случаях клеточный пласт оказался частично прикрыт веществом БМ в пределах своих контуров. Очевидно, в этой зоне отделение эпителиального пласта произошло с захватом плотной пластинки и входящих в ее состав коллагенов. Известно, что при РЭР наблюдается избыток MMП-2 [2], который приводит к деструкции коллагена IV – основного вещества БМ, что и может приводить к ее «размягчению». В тех местах, где произошло отделение БМ по светлой пластинке, для наблюдения доступна «ворсинчатая структура» эпителиоцитов (рис. 3д).
Выводы
Новый метод визуализации на сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием позволяет выявить особенности строения в биоптатах эпителиальной ткани роговицы при различных патологических состояниях. Полученные результаты подтверждают данные о несостоятельности якорного комплекса адгезии при развитии рецидивирующей эрозии роговицы.
