Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар с демонстрацией живой хирургии

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар с демонстрацией живой хирургии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар с демонстрацией живой хирургии

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар с демонстрацией живой хирургии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.731


DOI: https://doi.org/10.25276/0235-4160-2017-2-28-36

Предоперационная подготовка клеточных трансплантатов лимба для лечения оптических нейропатий (экспериментальное исследование)


     В настоящее время в регенеративной медицине широко разрабатываются подходы клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний посредством пролонгированной секреции нейротрофических факторов (НТФ) – семейства крупных полипептидов, регулирующих выживание, развитие и функцию нейронов [2]. В офтальмопатологии к таким нейродегенеративным заболеваниям относится первичная открытоугольная глаукома, которая характеризуется прогрессирующей оптической нейропатией с патологическим изменением полей зрения вследствие гибели ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) [4]. С эпидемиологической точки зрения первичная глаукома является одной из главных причин слепоты и инвалидности по зрению, и, по данным Quigley H.A. [19], число таких пациентов в мире к 2020 г. достигнет 79,6 млн.

    В последнее время появляются единичные публикации, в которых авторы в качестве источников клеточной терапии глаукомной оптиконейропатии изучают возможность использования клеток-предшественников олигодендроцитов, клеток Мюллера, ММСК костного мозга [13]. К настоящему времени доступность жизнеспособного клеточного материала и снятие ряда этических проблем, отсутствие признаков трансформации и образования тератом обусловливают широкие перспективы использования ММСК в клинике для клеточной трансплантации и терапии.

    В ряде исследований показана эффективность ММСК в восстановлении и регенерации поврежденной нервной ткани в центральной и периферической нервной системе [11, 23]. В единичных экспериментальных работах показана выраженная нейропротекция ГКС после трансплантации ММСК в полость стекловидного тела глаза крысы с индуцированной офтальмогипертензией и признаками оптиконейропатии [11, 12]. При этом патогенетический механизм действия клеточной терапии остается до конца не установленным, однако предполагается, что лечебный эффект ММСК обусловлен интеграцией донорских клеток в тканевые ниши реципиента, секреторной активностью и иммуномодулирующим действием после их трансплантации [22].

    Интеграция ММСК при трансплантации требует строительства крайне сложных аксональных связей в сетчатке и в головном мозге реципиента. В 2005 г. Gnecchi M. [10] выдвинул концепцию, согласно которой терапевтический потенциал ММСК в основном связан с секретируемыми в межклеточное пространство биологически активными факторами. В те же годы в работе Crigler L. и соавт. была показана возможность выделения ММСК нейротрофических факторов [8]. Было установлено, что в норме ГКС получают НТФ посредством ретроградного аксоплазматического транспорта [14]. Однако при глаукоме стойкое повышение ВГД приводит к прогибанию решетчатой мембраны и деформации просветов микротубул. В деформируемых канальцах возникают «стригущие» усилия встречных стенок [9], приводящие к компрессии заключенных в суженных канальцах аксонов с последующим нарушением быстрого аксоплазматического тока [16]. Данные изменения запускают механизм патологического апоптоза, обусловливающего прогрессирование каскада гибели клеток, даже на фоне стабилизированного ВГД [18]. В этой связи трансплантация культивированных ММСК в тканевые ниши сетчатки и других внутриглазных структур при глаукомной оптиконейропатии нам представляется патогенетически некорректной и требует дальнейшего поиска адекватных условий клеточной терапии.

     В настоящее время широко изучаются протоколы индукции ММСК, направленные на стимуляцию секреции НТФ. В ряде экспериментальных работ было подтверждено более выраженное нейропротекторное действие на ГКС индуцированных ММСК по сравнению с неиндуцированными [20, 21, 24]. Но эти работы проводились с использованием плоскостных 2D-культур клеток. Известно, что в условиях 2D-культивирования естественные процессы в клеточном микроокружении воспроизводятся не в полной мере, что отрицательно влияет на их функции [7]. Культивирование ММСК в 2D-культурах может изменять их нормальное физиологическое поведение и приводить к потере пролиферативной и секреторной активности [6, 15]. Наиболее эффективной и максимально приближенной по свойствам и организации к естественной клеточно-тканевой системе может рассматриваться 3D-культура в виде клеточных сфероидов.

    В последнее время широко изучаются ММСК лимба, которые относятся к истинным ММСК [17] и могут быть использованы в клинике глазных болезней как альтернатива костномозговым мезенхимальным клеткам [1]. В доступной литературе нам не удалось найти данных об индукции 3D-клеточных культур ММСК лимба, направленной на секрецию наиболее значимых НТФ.

    Цель

    Изучить в эксперименте in vitro секрецию фактора роста нервов (ФРН) и нейроростового фактора головного мозга (НФГМ) интактными и индуцированными мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками лимба (ММСК) в трехмерной культуре (3D).

    Материал и методы

    Отбор, выделение и культивирование ММСК лимба

    В качестве первичного источника ММСК использовались лимбальные фрагменты глазных яблок доноров-трупов.

    Экспериментальные исследования на тканях, выделенных из трупных донорских глаз человека, проводились в соответствии с утвержденными процедурами, законодательными и нормативно-правовыми документами с учетом Лицензии на виды медицинской деятельности Росздравнадзора № ФС-99-01-008251 от 18.02.2013 г., выданной ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Для выделения ММСК было использовано 8 глазных яблок от 4 доноров-трупов (табл. 1).

    Глазные яблоки от доноров-трупов отбирались с учетом критериев посмертной жизнеспособности клеток по показателю периода после смерти (до 18 час), возрастному лимиту (не более 65 лет) и адреналиновой пробы на клеточную витальность (степени А или В по Борзенку С.А., 2008).

    Тканевые фрагменты лимба выделялись по ранее предложенной технике [5]. Для чистоты выделения ММСК лимба механическим путем предварительно удалялся слой переднего эпителия.

     Изолированные фрагменты лимба переносились в 25 см3 культуральные матрасы, инкубирование осуществлялось в среде DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия) с добавлением L-глутамина – 0,58 г/л, HEPES – 10 mМ, пенициллина – 10000 ЕД/мл, стрептомицина – 10000 ЕД/мл, амфотерицина В – 1,25 мг/мл, инсулина – 0,4 мкМ, дексаметазона – 10 нМ и 10 об. % фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) при стандартных условиях (5% СО2, 37° C), смена среды проводилась через каждые 3 суток. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществлялось пассирование культуры с использованием растворов версена и 0,25% трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия). Подсчет клеток при пассировании культуры производился с использованием камеры Горяева. В экспериментальных сериях использовались культуры ММСК четвертого пассажа, достигшие 80-90% конфлуэнтности.

    Проведение проточной цитофлуориметрии

    Для определения иммунофенотипа полученной культуры клеток применялся метод проточной цитофлуориметрии со следующими маркерными белками: CD90 FITC, CD105 PE, CD73 PE (Biolegend, США), CD133 PE (Miltenyi Biotec GmbH, США), CD19 PE (BD Biosciences, США).

    Клетки отмывались от полной ростовой среды раствором Версена, обрабатывались 0,25%-ным раствором трипсина-ЭДТА. Действие фермента инактивировалось добавлением 10 об. % фетальной бычьей сыворотки, подсчитывалось количество клеток и проводилось их центрифугирование (300 g, 5 мин). Полученный осадок ресуспендировался в растворе фосфатно-солевого буфера (рН=7,4) с 1 об. % фетальной бычьей сыворотки и аликвотировался. Каждая пробирка инкубировалась в темноте (при 250 С, 15 мин) с антителами (10 мкл раствора антител на 1 млн. клеток). Полученные результаты анализировались на проточном цитофлуориметре «CytoFLEX» (Beckman Coulter Inc, США).

    Проведение индукции секреции нейротрофических факторов ММСК лимба

    Индукция секреции НТФ ММСК лимба осуществлялась по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации. Первый этап: EGF, hbFGF (ПанЭко, Россия), добавка N2 (Life Technologies, США); второй этап через 72 часа: дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF (R&D Systems, США), 3-изобутил-1-метилксантин (Santa Cruz Biotechnology, США).

    Создание клеточных 3D-сфероидов

    Из охарактеризованной 2D-культуры ММСК лимба создавались 3D-сфероиды с использованием неадгезивных 256-луночных агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США): I группа – контрольная, без индукции; II группа – с индукцией сфероидов на 1 сутки культивирования; III группа – с индукцией сфероидов на 7 сутки культивирования. Посевная концентрация ММСК составляла 256000 кл/мл.

    Световая микроскопия

     Полученные 2D- и 3D-культуры ММСК лимба анализировались с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 (Olympus, Япония) в проходящем свете, фазовом контрасте и темном поле.

    Проведение иммуноферментного анализа

    Для исследования содержания нейротрофических факторов ФРН и НФГМ методом ИФА супернатанты клеточных культур отбирались в разные сроки культивирования и хранились при t=800 C в соответствии с инструкцией производителя (Almabion). ИФА проводился на микропланшетном фотометре «Anthos» (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия). Статистическая обработка выполнялась на персональном компьютере с использованием стандартных статистических программ.

    Результаты

    ММСК лимба в условиях 2D-культивирования формировали монослой и имели характерную веретеновидную форму (рис. 1).

    Полученная культура клеток лимба экспрессировала характерные для ММСК костного мозга маркеры (CD105, CD90, CD73), практически не экспрессировала маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда CD133, CD 19 (табл. 2).

    При исследовании динамики сфероидообразования в контрольной группе уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в агрегаты (рис. 2a, б), которые к концу 7 суток формировали компактные, плотные сфероиды с гладким поверхностным слоем (рис. 2в).

    Во II группе после индукции на 4-е сутки сфероиды приобретали «бугристость» (рис. 3а, б), что было обусловлено стимуляцией пролиферативной активности клеток, формирующих сфероид. Однако в дальнейшем отмечались разрыхление клеточного конгломерата, потеря компактности и появление бахромчатости (рис. 3в), что являлось косвенным свидетельством нежизнеспособности.

    В III группе индукция проводилась на 7-е сутки, соответствующие сроку окончания сфероидообразования [3]. При этом индукция вызывала такие же изменения, как и во II группе (рис. 4). Дальнейшая экспозиция клеток в 3D-культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов (рис. 2г, 3г, 4г).

     Одним из критериев жизнеспособности сфероидов является их способность к адгезии. В I группе при 2D-культивировании в первые сутки сфероиды прикреплялись к поверхности дна лунок культуральных планшетов и в течение последующих дней «распластывались» с образованием слоя клеток вокруг изначальной зоны их прикрепления. Образуемый клеточный слой являлся неоднородным. Так в центре слоя находился остаток сфероида, а клетки образуемого периферического монослоя по своей морфологии были близки к веретенообразной ворме (рис. 5a). Во II и III группах адгезия отсутствовала, что, скорее всего, свидетельствовало о нежизнеспособности полученных конструкций (рис. 5б, в).

    Таким образом, несмотря на литературные данные о необходимости стимуляции плоскостных 2D-культур, для 3D-сфероидов впервые было выявлено отрицательное влияние предложенных индукторов на жизнеспособность клеток.

    Динамика содержания нейротрофических факторов ФРН и НФГМ в инкубационной среде по группам исследования представлена в табл. 3 и 4.

    При оценке динамики содержания НФГМ в культуральной жидкости в I группе отмечалось умеренное снижение уровня фактора лишь к концу периода наблюдения: к 21 суткам концентрация составляла 461,59±23,09 пг/мл. Индукция во II и III группах способствовала увеличению содержания НФГМ в 1,5 раза и составляла в среднем 870,7±20,2 и 871±18,2 пг/мл соответственно. Однако в дальнейшем отмечалось выраженное снижение продукции в 3,4 и 2,6 раза и к 21 суткам соответствовало 250,5±18,9 и 330±14,1 пг/мл, т.е. в 1,4 раза меньше по сравнению с группой контроля.

    Заключение

    Клеточные сфероиды, созданные из 2D-культуры интактных ММСК лимба методом трехмерного культивирования, способны в достаточных терапевтических концентрациях спонтанно синтезировать ФРН и НФГМ, являются наиболее оптимальной конструкцией для трансплантации в экстрабульбарные и интраокулярные тканевые ниши глазного яблока, являются потенциальным источником пролонгированной секреции нейроростовых факторов в клеточной терапии оптических нейропатий.


Страница источника: 28-36

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:article24809
Просмотров: 2213



Johnson & Johnson
Alcon
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek