2.5 Выделение и изучение МСК из жирового тела глазницы

    2.5.1 Определение оптимального материала и условий для выделения МСК из жирового тела глазницы

     На этапе определения оптимального источника получения МСК использованы 11 образцов кадаверного ЖТГ от доноров-трупов в возрасте 41– 73 лет и 13 образцов ЖТГ, резецированных в ходе плановых реконструктивно-восстановительных вмешательств на глазничной области у пациентов 6–65 лет.

    2.5.1.1 Измерение объема фрагмента жировой ткани

    Точное измерение первоначального объема фрагмента ЖТГ проводили согласно оригинальной методике (патент РФ № 2631636 с приоритетом от 18.08.2016). Стерильный одноразовый шприц объемом 2,0 мл частично заполняли стерильным физиологическим раствором. После обтурации отверстия на кончике шприца аккуратно удаляли поршень. Отмечали первоначальный уровень жидкости в шприце (V0), после чего в него стерильным пинцетом помещали образец ЖТГ (рисунок 5 а, б). Отмечали конечный уровень жидкости (V1 ). Объем образца ЖТГ (Vжт) вычисляли по формуле (1):

    Vжт = V1 – V0 . (1)

    После измерения фрагмент(ы) жировой ткани извлекали стерильным пинцетом и помещали в чашку Петри для дальнейшей обработки.

    2.5.1.2 Методика выделения МСК из жирового тела глазницы

    Первоначально выделение МСК проводилось согласно стандартной методике, описанной в литературе [72, 84, 106, 173]. Сначала образец ЖТГ выдерживали в течение 0,5–2 часов в физиологическом растворе с добавлением смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; MPBiomedicals, LLC, США). Все последующие этапы проводили в ламинарном боксе II класса безопасности MSC-Advantage (Scientific Technologies, Германия). Образец измельчали ножницами до получения фрагментов диаметром 1,0–2,0 мм, после чего заливали раствором коллагеназы II типа («MPBiomedicals», LLC, США) в сбалансированном растворе Хенкса («ПанЭко», Россия), в соотношении 1 мг/мл на 0,1 мл жировой ткани.

    Инкубировали в течение 60 минут при температуре 37 0 С при постоянном помешивании в шейкере (Asys Thermostar, «Biochrom», Ltd, Великобритания).

    После этого полученную массу пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 190 мкм, фильтрат переливали в пластиковую центрифужную пробирку, добавляли 5,0 мл DMEM/F12 (полная ростовая среда Игла в модификации Дульбекко и среда Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему, «ПанЭко», Россия) с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, «Thermo Scientific», США) и центрифугировали в лабораторной центрифуге SL-40 R («Thermo Scientific», Германия) при 1300 об/мин в течение пяти минут. После этого верхнюю фракцию (свободные липиды, тканевой дебрис) и надосадочную жидкость удаляли из пробирки. Осадок ресуспендировали с добавлением 1,0 мл полной культуральной среды и переносили в пластиковый ф лакон, в который затем наливали 4,0 мл DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) с добавлением 2,0 ммоль L-глутамина («ПанЭко», Россия), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; «MPBiomedicals», LLC, США). Культивирование проводили в стандартных условиях в инкубаторе (NU-5510, «NuAire», США) при температуре 37 0 С и 5 % СО2 в атмосфере. Смену среды проводили на 2-е сутки, при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции. Далее среду меняли каждые 3–4 дня.

    В связи с необходимостью выделять максимально возможное количество стромальных клеток из малого объема ЖТГ стандартная методика была модифицирована (патент РФ № 2609657 с приоритетом от 22.10.2015). При этом после центрифугирования верхнюю фракцию, содержащую нерасщепленные фрагменты ЖТГ, не удаляли, а собирали с помощью одноканальной автоматической пипетки («Ленпипет Дигитал» 100–1000 мкл, «Термо Фишер Сайентифик», Россия) и переносили в культуральный флакон. Надосадочную жидкость удаляли из пробирки. Осадок ресуспендировали с добавлением 1,0 мл полной питательной среды и переносили в тот же культуральный флакон, в который затем наливали 4,0 мл той же полной питательной среды. Смену среды проводили на 2-е сутки, при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции, а также тканевой дебрис. Далее среду меняли каждые 3–4 дня.

    2.5.2 Определение фенотипа клеток, выделенных из жирового тела глазницы

    Каждые сутки культивирования просматривали культуральные флаконы с помощью фазово-контрастной световой микроскопии на инвертированном микроскопе IX-81 («Olympus», Япония) и фотографировали с помощью интегрированной цифровой фотокамеры XC-10 («Olympus», Япония). При достижении 90–100%-ной конфлюентности клетки снимали с поверхности пластика по стандартной методике. Из культурального флакона удаляли питательную среду, трижды промывали раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия). После этого в культуральный флакон добавляли 0,25%-ный раствор трипсина и инкубировали при постоянном помешивании семь минут. По истечении этого времени содержимое флакона переносили в пластиковую пробирку с равным объемом раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия). Центрифугировали пять минут при 37 0 С со скоростью 1300 об/мин, удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 1,0 мл полной питательной среды. Подсчет количества клеток проводили с помощью камеры Горяева («МиниМед», Россия) по стандартной методике.

    Соответствие фенотипа выделенных клеток критериям отнесения к МСК определяли по следующим признакам [107, 148]:

    – адгезия к поверхности культурального пластика;

    – характерная фибробластоподобная отростчатая форма;

    – морфология культуры, характеризующаяся образованием линий роста, вследствие активной миграции клеток;

    – экспрессия типичных поверхностных CD маркеров.

    Иммунофенотипирование клеточных популяций проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител, меченных флюорисцеининизоционатом (FITC), фикоэритрином (PE), аллофикоцианином (APC), фикоэритрином-цианином-7 PC7, аллофикоцианином Alexa Fluor 7 (APC-A750) к антигенам CD9, CD10, CD13, CD19, CD29, CD34, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166 (все производства «Beckman Coulter», США).

    В качестве изотипического контроля к антителам использовались аналогично меченые IgG соответствующего класса. Фенотипирование проводили по стандартной методике на проточном цитофлюориметре CytoFlex («Beckman Coulter», США) согласно инструкции производителя.

    2.5.3 Изучение секреторной способности МСК жирового тела глазницы

    В исследование вошло 18 культур МСК, выделенных из образцов ЖТГ 14-ти пациентов (мужчин – три, женщин – 11) в возрасте 3–84 лет, по вышеописанной модифицированной методике (см. раздел 2.5.1.3). Для определения концентрации цитокинов (VEGF A и TGF-β 2) в среде культивирования МСК, выделенных из ЖТГ, проводили забор образцов кондиционированной питательной среды на 2-е (т. е. через 48 часов после посева), затем на 5-е сутки (т. е. через 72 часа после первой смены среды) перед сменой питательной среды на свежую аналогичного состава. До проведения анализа образцы культуральной жидкости хранили в эппендорфах при температуре минус 80 ° С.

    Количественную оценку содержания цитокинов в образцах культуральной среды проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов: «Human VEGF-A Platinum ELISA» («eBioscience», «ThermoFisher Scientific», США), «Набор для иммуноферментного анализа трансформирующего ростового фактора β 2 человека» (OOO «Альма-Бион», Россия) – на ИФА-анализаторе для микропланшетов («Asys Hitech», Япония) при длине волны 450 нм. Исследование обоих факторов проводили в дублях.