Онлайн доклады

Онлайн доклады

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Все видео...

2.5 Выделение и изучение МСК из жирового тела глазницы


    2.5.1 Определение оптимального материала и условий для выделения МСК из жирового тела глазницы

     На этапе определения оптимального источника получения МСК использованы 11 образцов кадаверного ЖТГ от доноров-трупов в возрасте 41– 73 лет и 13 образцов ЖТГ, резецированных в ходе плановых реконструктивно-восстановительных вмешательств на глазничной области у пациентов 6–65 лет.

    2.5.1.1 Измерение объема фрагмента жировой ткани

    Точное измерение первоначального объема фрагмента ЖТГ проводили согласно оригинальной методике (патент РФ № 2631636 с приоритетом от 18.08.2016). Стерильный одноразовый шприц объемом 2,0 мл частично заполняли стерильным физиологическим раствором. После обтурации отверстия на кончике шприца аккуратно удаляли поршень. Отмечали первоначальный уровень жидкости в шприце (V0), после чего в него стерильным пинцетом помещали образец ЖТГ (рисунок 5 а, б). Отмечали конечный уровень жидкости (V1 ). Объем образца ЖТГ (Vжт) вычисляли по формуле (1):

    Vжт = V1 – V0 . (1)

    После измерения фрагмент(ы) жировой ткани извлекали стерильным пинцетом и помещали в чашку Петри для дальнейшей обработки.

    2.5.1.2 Методика выделения МСК из жирового тела глазницы

    Первоначально выделение МСК проводилось согласно стандартной методике, описанной в литературе [72, 84, 106, 173]. Сначала образец ЖТГ выдерживали в течение 0,5–2 часов в физиологическом растворе с добавлением смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; MPBiomedicals, LLC, США). Все последующие этапы проводили в ламинарном боксе II класса безопасности MSC-Advantage (Scientific Technologies, Германия). Образец измельчали ножницами до получения фрагментов диаметром 1,0–2,0 мм, после чего заливали раствором коллагеназы II типа («MPBiomedicals», LLC, США) в сбалансированном растворе Хенкса («ПанЭко», Россия), в соотношении 1 мг/мл на 0,1 мл жировой ткани.

    Инкубировали в течение 60 минут при температуре 37 0 С при постоянном помешивании в шейкере (Asys Thermostar, «Biochrom», Ltd, Великобритания).

    После этого полученную массу пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 190 мкм, фильтрат переливали в пластиковую центрифужную пробирку, добавляли 5,0 мл DMEM/F12 (полная ростовая среда Игла в модификации Дульбекко и среда Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему, «ПанЭко», Россия) с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, «Thermo Scientific», США) и центрифугировали в лабораторной центрифуге SL-40 R («Thermo Scientific», Германия) при 1300 об/мин в течение пяти минут. После этого верхнюю фракцию (свободные липиды, тканевой дебрис) и надосадочную жидкость удаляли из пробирки. Осадок ресуспендировали с добавлением 1,0 мл полной культуральной среды и переносили в пластиковый ф лакон, в который затем наливали 4,0 мл DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) с добавлением 2,0 ммоль L-глутамина («ПанЭко», Россия), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; «MPBiomedicals», LLC, США). Культивирование проводили в стандартных условиях в инкубаторе (NU-5510, «NuAire», США) при температуре 37 0 С и 5 % СО2 в атмосфере. Смену среды проводили на 2-е сутки, при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции. Далее среду меняли каждые 3–4 дня.

    В связи с необходимостью выделять максимально возможное количество стромальных клеток из малого объема ЖТГ стандартная методика была модифицирована (патент РФ № 2609657 с приоритетом от 22.10.2015). При этом после центрифугирования верхнюю фракцию, содержащую нерасщепленные фрагменты ЖТГ, не удаляли, а собирали с помощью одноканальной автоматической пипетки («Ленпипет Дигитал» 100–1000 мкл, «Термо Фишер Сайентифик», Россия) и переносили в культуральный флакон. Надосадочную жидкость удаляли из пробирки. Осадок ресуспендировали с добавлением 1,0 мл полной питательной среды и переносили в тот же культуральный флакон, в который затем наливали 4,0 мл той же полной питательной среды. Смену среды проводили на 2-е сутки, при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции, а также тканевой дебрис. Далее среду меняли каждые 3–4 дня.

    2.5.2 Определение фенотипа клеток, выделенных из жирового тела глазницы

    Каждые сутки культивирования просматривали культуральные флаконы с помощью фазово-контрастной световой микроскопии на инвертированном микроскопе IX-81 («Olympus», Япония) и фотографировали с помощью интегрированной цифровой фотокамеры XC-10 («Olympus», Япония). При достижении 90–100%-ной конфлюентности клетки снимали с поверхности пластика по стандартной методике. Из культурального флакона удаляли питательную среду, трижды промывали раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия). После этого в культуральный флакон добавляли 0,25%-ный раствор трипсина и инкубировали при постоянном помешивании семь минут. По истечении этого времени содержимое флакона переносили в пластиковую пробирку с равным объемом раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия). Центрифугировали пять минут при 37 0 С со скоростью 1300 об/мин, удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 1,0 мл полной питательной среды. Подсчет количества клеток проводили с помощью камеры Горяева («МиниМед», Россия) по стандартной методике.

    Соответствие фенотипа выделенных клеток критериям отнесения к МСК определяли по следующим признакам [107, 148]:

    – адгезия к поверхности культурального пластика;

    – характерная фибробластоподобная отростчатая форма;

    – морфология культуры, характеризующаяся образованием линий роста, вследствие активной миграции клеток;

    – экспрессия типичных поверхностных CD маркеров.

    Иммунофенотипирование клеточных популяций проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител, меченных флюорисцеининизоционатом (FITC), фикоэритрином (PE), аллофикоцианином (APC), фикоэритрином-цианином-7 PC7, аллофикоцианином Alexa Fluor 7 (APC-A750) к антигенам CD9, CD10, CD13, CD19, CD29, CD34, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166 (все производства «Beckman Coulter», США).

    В качестве изотипического контроля к антителам использовались аналогично меченые IgG соответствующего класса. Фенотипирование проводили по стандартной методике на проточном цитофлюориметре CytoFlex («Beckman Coulter», США) согласно инструкции производителя.

    2.5.3 Изучение секреторной способности МСК жирового тела глазницы

    В исследование вошло 18 культур МСК, выделенных из образцов ЖТГ 14-ти пациентов (мужчин – три, женщин – 11) в возрасте 3–84 лет, по вышеописанной модифицированной методике (см. раздел 2.5.1.3). Для определения концентрации цитокинов (VEGF A и TGF-β 2) в среде культивирования МСК, выделенных из ЖТГ, проводили забор образцов кондиционированной питательной среды на 2-е (т. е. через 48 часов после посева), затем на 5-е сутки (т. е. через 72 часа после первой смены среды) перед сменой питательной среды на свежую аналогичного состава. До проведения анализа образцы культуральной жидкости хранили в эппендорфах при температуре минус 80 ° С.

    Количественную оценку содержания цитокинов в образцах культуральной среды проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов: «Human VEGF-A Platinum ELISA» («eBioscience», «ThermoFisher Scientific», США), «Набор для иммуноферментного анализа трансформирующего ростового фактора β 2 человека» (OOO «Альма-Бион», Россия) – на ИФА-анализаторе для микропланшетов («Asys Hitech», Япония) при длине волны 450 нм. Исследование обоих факторов проводили в дублях.


Страница источника: 51-56

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:article27476
Просмотров: 1132




Johnson & Johnson
Alcon
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek