Онлайн доклады

Онлайн доклады

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:УДК 617.7

DOI: https://doi.org/10.25276/2307-6658-2018-4-33-37

Моделирование цитотоксического воздействия препарата «Коллализин» в различных концентрациях на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 в условиях in vitro


     Несмотря на то что препарат «Коллализин», лиофилизат для местного и парентерального введения, в отечественной офтальмологической практике применяется с 1960 г. [2], остается открытым вопрос его дозозависимости. Применяемые дозы препарата варьируют в чрезвычайно широких пределах от 1 КЕ [1] до 12000 КЕ на одну инъекцию [3]. Для интравитреального введения в клинической практике доза водимого препарата варьирует от 1 КЕ [1] до 30 КЕ [4]. В литературе описано воздействие коллагеназы на внутриглазные структуры [5], однако исследования произведены в условиях in vivo, что не дает точной картины воздействия на клеточном уровне. Ранее были проведены узконаправленные исследования токсичности коллагеназы на выделенной культуре клеток в аспекте интравитреального применения, но экспозиция воздействия была ограничена 30 мин., исследование проведено в узком диапазоне дозировок [4]. Исследования токсического воздействия коллагеназы в более широком диапазоне доз и экспозиции на клеточном уровне не проводились. Таким образом, представляется целесообразным исследование цитотоксического действия коллагеназы в расширенном диапазоне доз и экспозиции в аспекте интравитреального применения.

    Коллализин является зарегистрированным препаратом, и проведение масштабных исследований токсичности на животных не целесообразно. Тем более совершенно невозможно установить зависимость «доза-эффект» от времени экспозиции на клеточном уровне при интравитреальном введении в эксперименте in vivo. Представляется интересной возможность создания модели в условиях in vitro, так как общебиологические законы распространяются как на организм в целом, так и на отдельные его тканевые и клеточные компоненты. Исследование на клеточных культурах позволяет установить с более высокой точностью «доза – эффект зависимости» с последующим экстраполяционным моделированием токсического воздействия, что крайне затруднительно сделать при экспозиции низкими дозами на животных из-за имеющейся неопределенности ответной реакции. Модели «доза-реакция», основывающиеся на результатах экспериментов in vitro, могут предоставить адекватные данные, достаточные для принятия решения по определению степени риска применения тех или иных исследуемых веществ. Моделирование токсичности с использованием тестов на клеточной культуре может быть основным и эффективным инструментом для определения отношений «доза-реакция». Такая модель может быть экстраполирована из условий in vitro в in vivo. Определение взаимосвязи между изменением концентрации и экспозиции исследуемого вещества на тест-систему позволяет зарегистрировать концентрации и экспозицию появления и нарастания эффектов негативного воздействия. В аспекте исследования «доза-реакция» применительно к препарату «Коллализин» актуальным является определение диапазона безопасной дозировки применения препарата с точки зрения возможного токсического для клеток воздействия.

    Цель

    Определение диапазона безопасной, в аспекте токсического воздействия, дозы препарата «Коллализин» на культуре фибробластов с использованием модели «доза – эффект зависимости».

    Материал и методы

    Проведено изучение цитотоксичности препарата «Коллализин» производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток в возрастающих дозах с различной экспозицией. Исследование произведено на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 для определения отношений «доза-реакция». Работа выполнена на базе Института медико-биологических исследований и технологий (АНО «ИМБИИТ»). За основу были взяты рекомендации международного стандарта ГОСТ РИСО 10993.5-99. Часть 5. «Исследование на цитотоксичность: методы in vitro», который является обязательным в исследовании цитотоксичности медицинских изделий. Культура фибробластов мыши линии NIH 3Т3 признана стандартной для такого рода исследований. Исследованиям на цитотоксичность подвергали раствор препарата «Коллализин» в концентрациях: 5 КЕ / 100 мкл, 15 КЕ / 100 мкл, 30 КЕ / 100 мкл, 40 КЕ / 100 мкл, 60 КЕ / 100 мкл, 80 КЕ / 100 мкл, 120 КЕ / 100 мкл с возрастающим временем экспозиции 10, 20, 30 мин., 1, 3, 24 часа.

    Схема эксперимента. В эксперименте проверяли цитотоксичность различных концентраций препарата «Коллализин» в зависимости от времени инкубации с культурой фибробластов мыши линии NIH 3Т3. Клетки высевали в культуральные плоскодонные 96-луночные планшеты и инкубировали 24 ч во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2 до образования 80±10% монослоя, затем вносили в культуру исследуемый препарат в различных концентрациях. На каждую концентрацию – не менее 3 лунок. Морфологию и лизис клеток оценивали через 5 мин, 10 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 24 ч инкубации при температуре 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2 . Отрицательным контролем служила среда F-12 без сыворотки, положительным – раствор цинка в азотной кислоте (Zn 1-2 wt.% HNO3 , разбавление 1:100 физиологическим раствором).

    Различные дозы препарата «Коллализин» были промаркированы. Маркировка представлена в табл. 1.

    Подготовка клеток. Клетки удаляли из культурального флакона методом трипсинизации, ресуспендировали культуральной средой, содержащей сыворотку. Готовили суспензию клеток с необходимой концентрацией 1–2х105 кл/мл. Определение количества клеток в суспензии проводили с использованием гемоцитометра (камеры Горяева). Клетки высевали в культуральные 96-луночные плоскодонные планшеты, добавляя по 100 мкл суспензии необходимой концентрации в каждую лунку. Планшеты инкубировали 24 ч при 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО 2 , до образования клетками 80±10% монослоя. Уровень конфлюэнтности монослоя оценивали с помощью бинокулярного инвертированного микроскопа Биолам П-I (Россия) при увеличении х100.

     Контакт с образцами. Через 24 ч в лунки вносили испытываемые препараты в необходимых концентрациях в объеме 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч при температуре 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1 % СО 2 .

    Метод витальной окраски.Критерии оценки цитотоксичности экстрактов. Через 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч инкубации из планшета с препаратом удаляли содержимое и промывали фосфатным буфером. В каждую лунку добавляли 0,1% раствор витального красителя трипанового синего на фосфатном буфере. Через 1-2 мин краситель удаляли из лунок, аккуратно промывали лунки фосфатным буфером, после чего сразу же производили оценку культуры микроскопически на наличие морфологических изменений и/или уменьшение плотности клеток. Трипановый синий окрашивает лизированные клетки и/или клетки с поврежденными клеточными мембранами.

    Результаты

    Полученные результаты цитотоксической реакции культуры фибробластов мыши линии NIH 3Т3 интерпретировали с использованием таблицы «Градация степени ответной реакции клеток» (табл. 2).

    Проведенные испытания показали, что концентрация препарата «Коллализин», равная 15 КЕ в 100 мкл/лун, в условиях данного эксперимента не оказывает цитотоксического действия на культуру фибробластов мыши линии NIH 3Т3 даже через 24 ч. инкубации. Через 5 и 10 мин после инкубации все исследуемые концентрации не оказывают цитотоксического действия на культуру фибробластов. Через 30 мин, 1 и 3 ч. все концентрации препарата оказывают незначительное цитотоксическое действие на фибробласты. Через 24 часа незначительное цитотоксическое действие сохраняется при концентрации 30 КЕ в 100 мкл/лун. При концентрациях 40-120 КЕ в 100 мкл/лун наблюдается нерезкая цитотоксичность (табл. 3).

    Обсуждение

    Результаты исследований цитотоксичности препарата «Коллализин» на культуре фибробластов мыши в дозировке от 15 до 120 КЕ / 100 мкл указывают на умеренную цитотоксичность препарата при максимальной дозировке и экспозиции, что в целом положительно характеризует сам препарат с точки зрения его переносимости в аспекте потенциального токсического воздействия. Зависимость изменения концентрации и экспозиции от появления и нарастания эффектов негативного воздействия представлена на рис. При дозировке препарата 15 КЕ / 100 мкл и максимальной экспозиции не зарегистрировано признаков токсического воздействия. Концентрация появления эффекта негативного воздействия в виде незначительной токсической реакции зарегистрирована при дозе препарата 30 КЕ / 100 мкл и после экспозиции в 30 минут, без последующего нарастания токсической реакции со временем. Концентрация нарастания токсического эффекта от нулевой до нерезкой токсической реакции зарегистрирована при дозах препарата от 40 до 120 КЕ/мкл. После 30-минутной экспозиции регистрировалась незначительная токсическая реакция, которая к 24-м часам экспозиции возрастала до нерезкой. Следует обратить дополнительное внимание на то, что при этом не происходило дальнейшего нарастания токсической реакции, несмотря на увеличение дозы препарата от 40 к 120 КЕ/100 мкл. Отсутствие прямой линейной зависимости от увеличения дозы препарата и степени ответной реакции клеток указывает на изначально низкую цитотоксичность коллагеназы.

    Заключение

    Клеточная модель «доза-эффект» в зависимости от концентрации и экспозиции препарата «Коллализин» показала полное отсутствие цитотоксичности при дозировке 15 КЕ/100 мкл, нарастание цитотоксической реакции до незначительной при дозировке в 30 КЕ/100 мкл, увеличение реакции до нерезкой при увеличении дозировки от 40 до 120 КЕ / 100 мкл и отсутствие дальнейшего нарастания ответной реакции несмотря на увеличение дозы. Экстраполяция результатов модели из условий in vitro в in vivo позволяет сделать заключение, что дозировка препарата до 15 КЕ / 100 мкл не несет в себе потенциальной опасности токсического воздействия на биологические ткани даже при максимальной экспозиции. Доза от 30 КЕ / 100 мкл может оказывать незначительное токсическое воздействие на окружающие ткани при условии максимальной экспозиции. Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что применение препарата в клинике для внутриглазного введения при условии максимальной экспозиции безопасно в аспекте токсического воздействия при условии, если применяемая дозировка не превышает 15 КЕ / 100 мкл.

    

    Сведения об авторах

    Лыскин Павел Владимирович – канд. мед. наук, офтальмохирург отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Захаров Валерий Дмитриевич – докт. мед. наук, профессор, зав. отделом витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Перова Надежда Викторовна – докт. биол. наук, зам. директора по научн.-практич. работе Автономной некоммерческой организации «Институт медико-биологических исследований и технологий».

    Лозинская Ольга Львовна – врач-офтальмолог Медицинского научно-образовательного центра МГУ им. М.В. Ломоносова

    Згоба Марьяна Игоревна – аспирант отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.


Страница источника: 33-37

Просмотров: 5453