Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Сателлитные симпозиумы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Онлайн семинар

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Онлайн семинар

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Сателлитные симпозиумы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Онлайн семинар

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Онлайн семинар

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:УДК 617.7

DOI: https://doi.org/10.25276/2307-6658-2018-4-33-37

Моделирование цитотоксического воздействия препарата «Коллализин» в различных концентрациях на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 в условиях in vitro


     Несмотря на то что препарат «Коллализин», лиофилизат для местного и парентерального введения, в отечественной офтальмологической практике применяется с 1960 г. [2], остается открытым вопрос его дозозависимости. Применяемые дозы препарата варьируют в чрезвычайно широких пределах от 1 КЕ [1] до 12000 КЕ на одну инъекцию [3]. Для интравитреального введения в клинической практике доза водимого препарата варьирует от 1 КЕ [1] до 30 КЕ [4]. В литературе описано воздействие коллагеназы на внутриглазные структуры [5], однако исследования произведены в условиях in vivo, что не дает точной картины воздействия на клеточном уровне. Ранее были проведены узконаправленные исследования токсичности коллагеназы на выделенной культуре клеток в аспекте интравитреального применения, но экспозиция воздействия была ограничена 30 мин., исследование проведено в узком диапазоне дозировок [4]. Исследования токсического воздействия коллагеназы в более широком диапазоне доз и экспозиции на клеточном уровне не проводились. Таким образом, представляется целесообразным исследование цитотоксического действия коллагеназы в расширенном диапазоне доз и экспозиции в аспекте интравитреального применения.

    Коллализин является зарегистрированным препаратом, и проведение масштабных исследований токсичности на животных не целесообразно. Тем более совершенно невозможно установить зависимость «доза-эффект» от времени экспозиции на клеточном уровне при интравитреальном введении в эксперименте in vivo. Представляется интересной возможность создания модели в условиях in vitro, так как общебиологические законы распространяются как на организм в целом, так и на отдельные его тканевые и клеточные компоненты. Исследование на клеточных культурах позволяет установить с более высокой точностью «доза – эффект зависимости» с последующим экстраполяционным моделированием токсического воздействия, что крайне затруднительно сделать при экспозиции низкими дозами на животных из-за имеющейся неопределенности ответной реакции. Модели «доза-реакция», основывающиеся на результатах экспериментов in vitro, могут предоставить адекватные данные, достаточные для принятия решения по определению степени риска применения тех или иных исследуемых веществ. Моделирование токсичности с использованием тестов на клеточной культуре может быть основным и эффективным инструментом для определения отношений «доза-реакция». Такая модель может быть экстраполирована из условий in vitro в in vivo. Определение взаимосвязи между изменением концентрации и экспозиции исследуемого вещества на тест-систему позволяет зарегистрировать концентрации и экспозицию появления и нарастания эффектов негативного воздействия. В аспекте исследования «доза-реакция» применительно к препарату «Коллализин» актуальным является определение диапазона безопасной дозировки применения препарата с точки зрения возможного токсического для клеток воздействия.

    Цель

    Определение диапазона безопасной, в аспекте токсического воздействия, дозы препарата «Коллализин» на культуре фибробластов с использованием модели «доза – эффект зависимости».

    Материал и методы

    Проведено изучение цитотоксичности препарата «Коллализин» производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток в возрастающих дозах с различной экспозицией. Исследование произведено на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 для определения отношений «доза-реакция». Работа выполнена на базе Института медико-биологических исследований и технологий (АНО «ИМБИИТ»). За основу были взяты рекомендации международного стандарта ГОСТ РИСО 10993.5-99. Часть 5. «Исследование на цитотоксичность: методы in vitro», который является обязательным в исследовании цитотоксичности медицинских изделий. Культура фибробластов мыши линии NIH 3Т3 признана стандартной для такого рода исследований. Исследованиям на цитотоксичность подвергали раствор препарата «Коллализин» в концентрациях: 5 КЕ / 100 мкл, 15 КЕ / 100 мкл, 30 КЕ / 100 мкл, 40 КЕ / 100 мкл, 60 КЕ / 100 мкл, 80 КЕ / 100 мкл, 120 КЕ / 100 мкл с возрастающим временем экспозиции 10, 20, 30 мин., 1, 3, 24 часа.

    Схема эксперимента. В эксперименте проверяли цитотоксичность различных концентраций препарата «Коллализин» в зависимости от времени инкубации с культурой фибробластов мыши линии NIH 3Т3. Клетки высевали в культуральные плоскодонные 96-луночные планшеты и инкубировали 24 ч во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2 до образования 80±10% монослоя, затем вносили в культуру исследуемый препарат в различных концентрациях. На каждую концентрацию – не менее 3 лунок. Морфологию и лизис клеток оценивали через 5 мин, 10 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 24 ч инкубации при температуре 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2 . Отрицательным контролем служила среда F-12 без сыворотки, положительным – раствор цинка в азотной кислоте (Zn 1-2 wt.% HNO3 , разбавление 1:100 физиологическим раствором).

    Различные дозы препарата «Коллализин» были промаркированы. Маркировка представлена в табл. 1.

    Подготовка клеток. Клетки удаляли из культурального флакона методом трипсинизации, ресуспендировали культуральной средой, содержащей сыворотку. Готовили суспензию клеток с необходимой концентрацией 1–2х105 кл/мл. Определение количества клеток в суспензии проводили с использованием гемоцитометра (камеры Горяева). Клетки высевали в культуральные 96-луночные плоскодонные планшеты, добавляя по 100 мкл суспензии необходимой концентрации в каждую лунку. Планшеты инкубировали 24 ч при 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО 2 , до образования клетками 80±10% монослоя. Уровень конфлюэнтности монослоя оценивали с помощью бинокулярного инвертированного микроскопа Биолам П-I (Россия) при увеличении х100.

     Контакт с образцами. Через 24 ч в лунки вносили испытываемые препараты в необходимых концентрациях в объеме 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч при температуре 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5±1 % СО 2 .

    Метод витальной окраски.Критерии оценки цитотоксичности экстрактов. Через 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч инкубации из планшета с препаратом удаляли содержимое и промывали фосфатным буфером. В каждую лунку добавляли 0,1% раствор витального красителя трипанового синего на фосфатном буфере. Через 1-2 мин краситель удаляли из лунок, аккуратно промывали лунки фосфатным буфером, после чего сразу же производили оценку культуры микроскопически на наличие морфологических изменений и/или уменьшение плотности клеток. Трипановый синий окрашивает лизированные клетки и/или клетки с поврежденными клеточными мембранами.

    Результаты

    Полученные результаты цитотоксической реакции культуры фибробластов мыши линии NIH 3Т3 интерпретировали с использованием таблицы «Градация степени ответной реакции клеток» (табл. 2).

    Проведенные испытания показали, что концентрация препарата «Коллализин», равная 15 КЕ в 100 мкл/лун, в условиях данного эксперимента не оказывает цитотоксического действия на культуру фибробластов мыши линии NIH 3Т3 даже через 24 ч. инкубации. Через 5 и 10 мин после инкубации все исследуемые концентрации не оказывают цитотоксического действия на культуру фибробластов. Через 30 мин, 1 и 3 ч. все концентрации препарата оказывают незначительное цитотоксическое действие на фибробласты. Через 24 часа незначительное цитотоксическое действие сохраняется при концентрации 30 КЕ в 100 мкл/лун. При концентрациях 40-120 КЕ в 100 мкл/лун наблюдается нерезкая цитотоксичность (табл. 3).

    Обсуждение

    Результаты исследований цитотоксичности препарата «Коллализин» на культуре фибробластов мыши в дозировке от 15 до 120 КЕ / 100 мкл указывают на умеренную цитотоксичность препарата при максимальной дозировке и экспозиции, что в целом положительно характеризует сам препарат с точки зрения его переносимости в аспекте потенциального токсического воздействия. Зависимость изменения концентрации и экспозиции от появления и нарастания эффектов негативного воздействия представлена на рис. При дозировке препарата 15 КЕ / 100 мкл и максимальной экспозиции не зарегистрировано признаков токсического воздействия. Концентрация появления эффекта негативного воздействия в виде незначительной токсической реакции зарегистрирована при дозе препарата 30 КЕ / 100 мкл и после экспозиции в 30 минут, без последующего нарастания токсической реакции со временем. Концентрация нарастания токсического эффекта от нулевой до нерезкой токсической реакции зарегистрирована при дозах препарата от 40 до 120 КЕ/мкл. После 30-минутной экспозиции регистрировалась незначительная токсическая реакция, которая к 24-м часам экспозиции возрастала до нерезкой. Следует обратить дополнительное внимание на то, что при этом не происходило дальнейшего нарастания токсической реакции, несмотря на увеличение дозы препарата от 40 к 120 КЕ/100 мкл. Отсутствие прямой линейной зависимости от увеличения дозы препарата и степени ответной реакции клеток указывает на изначально низкую цитотоксичность коллагеназы.

    Заключение

    Клеточная модель «доза-эффект» в зависимости от концентрации и экспозиции препарата «Коллализин» показала полное отсутствие цитотоксичности при дозировке 15 КЕ/100 мкл, нарастание цитотоксической реакции до незначительной при дозировке в 30 КЕ/100 мкл, увеличение реакции до нерезкой при увеличении дозировки от 40 до 120 КЕ / 100 мкл и отсутствие дальнейшего нарастания ответной реакции несмотря на увеличение дозы. Экстраполяция результатов модели из условий in vitro в in vivo позволяет сделать заключение, что дозировка препарата до 15 КЕ / 100 мкл не несет в себе потенциальной опасности токсического воздействия на биологические ткани даже при максимальной экспозиции. Доза от 30 КЕ / 100 мкл может оказывать незначительное токсическое воздействие на окружающие ткани при условии максимальной экспозиции. Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что применение препарата в клинике для внутриглазного введения при условии максимальной экспозиции безопасно в аспекте токсического воздействия при условии, если применяемая дозировка не превышает 15 КЕ / 100 мкл.

    

    Сведения об авторах

    Лыскин Павел Владимирович – канд. мед. наук, офтальмохирург отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Захаров Валерий Дмитриевич – докт. мед. наук, профессор, зав. отделом витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Перова Надежда Викторовна – докт. биол. наук, зам. директора по научн.-практич. работе Автономной некоммерческой организации «Институт медико-биологических исследований и технологий».

    Лозинская Ольга Львовна – врач-офтальмолог Медицинского научно-образовательного центра МГУ им. М.В. Ломоносова

    Згоба Марьяна Игоревна – аспирант отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.


Страница источника: 33-37

Просмотров: 5220