Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:УДК 617.713

DOI:https://doi.org/10.25276/2410-1257-2019-1-93-97

Лабораторные исследования механизмов персонализированной клеточной терапии поражений эндотелия роговицы в ФГБНУ «НИИГБ»



1Научно-исследовательский институт глазных болезней Российской академии медицинских наук

     Одними из наиболее тяжелых поражений роговицы являются те, при которых страдает задний эпителий роговицы (эндотелий). Терапевтических подходов к лечению таких состояний мало, поэтому привлекают внимание оригинальные методы воздействия на пораженный участок. Так, в НИИ ГБ разработан метод минимально-инвазивного воздействия на поврежденную роговицу – введение в переднюю камеру суспензии активированных лейкоцитов в процессированной сыворотке крови – персонализированная клеточная терапия (ПКТ). Проведенные клинические исследования метода ПКТ свидетельствуют о его безопасности и терапевтической эффективности в офтальмологической клинике для лечения ранней ПБК и герпесвирусного кератоиридоциклита и эндотелиита [1]. Однако, задача расшифровки механизма действия ПКТ не решена до конца, т.к. на живом глазу пациента мы не можем увидеть молекулярную картину происходящих процессов, а моделирование in vitro не способно воссоздать всю полноту взаимодействий, происходящих in vivo.

    В настоящем обзоре систематизированы результаты лабораторных исследований, связанных с изучением метода ПКТ, полученные в ФГБНУ НИИГБ на протяжении нескольких десятков лет.

    На первых этапах изучение механизма действия ПКТ было направлено на детальную характеристику вводимых субстанций, изучение эффектов стимулятора на клетки крови, анализ клеточного и цитокинового состава вводимого препарата, корреляцию с клиническим эффектом.

    Что же обуславливает эффективность ПКТ? Оригинальная методика выделения клеток позволяет получить из небольшого объёма периферической крови пациента клеточный препарат (КП), представляющий из себя взвесь аутологичных лейкоцитов в насыщенной цитокинами (процессированной) сыворотке. Она описана в публикациях авторского коллектива, работавшего над его созданием [2].

    Для получения КП сначала готовят раствор стимулятора – 200 ЕД препарата Полудан (ЗАО «Верофарм», РФ) в 2,0 мл воды для инъекций в стерильной пробирке на 10 мл. Из локтевой вены в пробирку с раствором набирают 8 мл крови. Затем раствор инкубируют 4 часа при температуре 37°С. За это время происходит коагуляция крови, частичная ретракция фибринового сгустка, синтезируются цитокины.

    На следующем этапе выделяют КП путем центрифугирования пробирки со свернувшейся кровью в течение 10 минут при 3000 об/мин., после чего собирают образовавшуюся светлую полосу из лейкоцитарных клеток, обводя иглой шприца, диаметром 0,8 мм, вокруг фибринового сгустка. Вместе с лейкоцитами захватывается сыворотка и некоторое количество эритроцитов. Полученную клеточную суспензию переносят в другую стерильную пробирку и доводят концентрацию клеток до 3 млн/мл (рис. 1).

    Полученный КП представляет из себя взвесь лейкоцитов в процессированной аутологичной сыворотке.

    Введение клеток во время операции, когда нарушается биологическая герметичность тканевой ниши, зачастую позволяет значительно усилить лечебный эффект КТ. Такая манипуляция получила название «интраоперационная клеточная терапия» [3].

    Именно такая манипуляция проводится при осуществлении ПКТ – водянистая влага передней камеры глаза заменяется на КП. Тем самым изменяется микроокружение эндотелиоцитов. Что же является терапевтически эффективным элементом в данном случае?

    Логично предположить, что можно воздействовать на патологический процесс через субстанции, вовлеченные в его регулирование в норме. В нашем случае самое уязвимое звено физиологической системы роговицы это низкая способность эндотелия роговицы взрослого человека к регенерации. И в данном случае необходимо снимать контактное ингибирование деления и нивелировать дисбаланс ростовых факторов, приводящий к «аресту» клетки в нерепликативной фазе [4, 5].

    Источником ростовых факторов и цитокинов в организме являются синтетически активные клетки, в том числе клетки крови. Вкупе с легкостью получения, компоненты крови являются удобным материалом для лечебного воздействия, т.е. введения больному живых клеток – клеточной терапии – КТ (с целью регенерации поврежденной ткани).

    Персонализированная же клеточная терапия подразумевает в т.ч. использование для лечения пациента его собственных клеток, интактных или каким-либо образом обработанных [6, 7].

    Принято считать, что механизмами, обусловливающими эффективность любой КТ, являются: а) заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая её функцию, и б) трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [8, 9]. Трансдифференцировка введенных клеток крови в поврежденный эндотелий роговицы вряд ли возможна, поэтому мы рассматривали трофический механизм действия как основной.

    В состав КП для ПКТ входят несколько важных компонентов: клетки крови – лейкоциты и эритроциты и процессированная сыворотка, в состав которой входят собственно сывороточные компоненты, раствор стимулятора – поли А:У и цитокины, синтезированные клетками крови за время инкубации.

    Нужно отметить, что состав используемой сыворотки принципиально отличается от свежеполученной нативной сыворотки, используемой в диагностических целях, и тем более от плазмы крови.

    При приготовлении КП используется синтетический комплекс полиадениловой-полиуридиловой кислот, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3 и 7 типа [10]. В диссертации Каспаровой Евг.А. описаны результаты огромной работы нескольких исследовательских коллективов и подробно описываются эффекты полудана [11]. Показано, что при инъекционном пути введения поли А:У сывороточный уровень интерферона повышается до 110 МЕ/мл.

    Исследования реакции лейкоцитов in vitro также свидетельствуют о том, что полудан стимулирует образование в высоких титрах всех трех видов интерферона –α, βи γ.

    Также была определена динамика интерферонообразования в разных фракциях крови. Для этого гепаринизированную венозную кровь разделяли центрифугированием на плазму, лейкомассу и эритроциты и оценивали содержание a и g интерферонов через каждые через 30 минут после стимуляции(рис. 2).

    Установлено, что интерферонообразование начинается сразу же после добавления препарата, достигая максимума через 1,5 часа. Наибольшие титры интерферонов ожидаемо были отмечены в лейкоцитарной фракции. Показано, что основной мишенью полудана в плане выработки интерферонов являются лейкоциты, а для накопления синтезированных цитокинов требуется как минимум 1,5 часа.

     Далее было исследовано влияние полудана на функциональное состояние клеток. Для этого оценивались пролиферация и апоптоз мононуклеарных клеток (МНК) здоровых доноров [12]. Для этого к МНК в присутствии ФГА (10мкг/мл) или декcаметазона (0,001мкг/мл) добавляли раствор полудана в дозах от 0,0001 до 1,0 МЕ/мл. Пролиферативная активность оценивалась по включению изотопа 3Н тимидина, апоптоз определяли на проточном цитофлюориметре по проценту окрашенных пропидий-йодидом клеток.

    Отмечено, что под влиянием полудана отмечаются два дозозависимых эффекта: индекс стимуляции пролиферации увеличивается и одновременно снижается уровень апоптоза.

    Следующим этапом изучения методики стала диссертационная работа Суббот А.М., посвященная исследованию клеточного и цитокинового состава КП [13].

    Оценку содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов и их субпопуляций в КП проводили путем микроскопического исследования КП, окрашенных по Романовскому – Гимзе и на проточном цитофлюориметре BDFACSAria (BDbiosciences, США) по параметрам светорассеяния и по иммуноцитохимическому окрашиванию.

    В результате, было показано, в состав клеточного препарата для ПКТ входят гранулоциты, моноциты и лимфоциты, при этом доля гранулоцитарной фракции увеличена по сравнению с кровью в 1,5 раза, соотношение Т-хелперов, Т-цитотоксических, NK-клеток соответствует их содержанию в крови, а содержание В-лимфоцитов по сравнению с кровью снижено на 80% [14].

    Активными регуляторами межклеточных взаимодействий являются цитокины и факторы роста, поэтому важной частью проделанной работы было их определение в КП(табл.).

    Содержание этих субстанций определяли методом иммуноферментного анализа в группах: стимулированных полуданом и контрольных КП. Для выяснения внутриклеточного содержания цитокинов проводилось их определение в образцах, где клетки были разрушены. Также для сравнения определялась концентрация цитокинов в сыворотке и плазме.

    Определяли концентрацию провоспалительных (ИЛ-1, -2, -6, -8, ФНО-α, ИФ-α, -γ), противовоспалительных (ИЛ-4, -10) и иммунорегуляторных (ИЛ-17) цитокинов, а также факторов роста, регулирующих функции клеток эндотелия роговицы (TGF-β1, TGF-β2, b-FGF, PDGF-AB, VEGF).

    Установлено что цитокиновый профиль КП формируется за счет нескольких пулов цитокинов (рис. 3): выделенных в ответ на стимуляцию поли А:У (ИФ-α, ИЛ-1,-6, ФНО-α); спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8); предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGF-β1, PDGF-AB, TGF-β2, VEGF, ИФ-γи ИЛ-4) [15].

    Изучение культуры МНК показало, что эти клетки отвечают на добавление в культуру поли A:У усилением синтеза ИФ-γ. На уровень ИЛ-4 и ФНО-αвнесение поли А:У не влияет. Отсутствие значимого увеличения содержания ФНО-α в культуре МНК при добавлении поли А:У даже через 24 часа свидетельствует о том, что источником этого цитокина в КП служат клетки гранулоцитарного ряда, а не МНК [16].

    Концентрация ИФ-γ, зарегистрированная в стимулированной культуре через 24 часа (193 пг/мл), на порядок превышает измеренную в КП (10,8 пг/мл). Можно предположить, что такая же ситуация наблюдается после введения КП в переднюю камеру, МНК в составе КП, продолжают синтезировать ИФ-γи увеличивают его концентрацию в водянистой влаге, что помогает в борьбе с вирусной инфекцией при герпетической природе поражения эндотелия.

    Концентрации TGF-β1, PDGF-AB и VEGF в КП на порядок превышают их физиологические концентрации в водянистой влаге передней камеры глаза, обеспечивающие в норме нерепликативное состояние эндотелиоцитов. Наличие широкого спектра цитокинов и факторов роста в составе сывороточной части КП позволяет рассматривать её в качестве отдельного терапевтического инструмента.

    Можно предположить, что при проведении ПКТ наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов рядом авторов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGF-β1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения [17-20]. Провоспалительные цитокины также участвуют в процессах регенерации – ФНО-αрегулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами [21, 22].

    Кроме того, провоспалительные цитокины ослабляют контакты между эндотелиоцитами, снимая один из механизмов ингибирования митоза [23]. Все это, вероятно, и приводит к наблюдаемому эффекту – восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы.

    Результаты определения клеточного состава и цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис. 4).

     Анализ цитокинового профиля КП обнаружил высокую концентрацию провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1 в сывороточной части КП у больных, хорошо отвечающих на проводимую ПКТ.

    Высокий уровень провоспалительных цитокинов, как правило, рассматривают в негативном ключе, т.к. концентрация этих веществ в жидких средах глаза неизбежно повышается в развитой стадии воспалительного процесса и отчасти является маркером тяжести заболевания. Однако, эффекты, опосредуемые цитокинами, могут сыграть и положительную роль в процессах регенерации, потому что провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, снимая тем самым один из механизмов ингибирования митоза.

    Корреляционный анализ по методу Спирмена показал, что результат лечения находится в умеренной прямой связи с концентрацией в клеточном препарате ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1.

    Полученные результаты согласуются с предложенной нами теорией о механизме действия клеточного препарата, реализующего свой эффект, в частности, за счет ослабления межклеточных связей, что позволяет клеткам заднего эпителия роговицы поделиться, или, как минимум, увеличивает их способность мигрировать и закрыть зону дефекта.

    Это предположение подтверждают иммуногистохимические исследования, показавшие более выраженное наличие маркера пролиферации ki-67 в образцах эндотелиальных лоскутов роговицы пациентов. Образцы получены в ходе операции задней послойной кератопластики у пациентов, применение ПКТ у которых не привело к значительному улучшению зрения, по сравнению с группой, в которой оперативное вмешательство проводилось по поводу буллезной кератопатии без проведения ПКТ. Кроме того, в образцах после ПКТ наблюдалось хорошее равномерное окрашивание белков плотных контактов ZO-1 (рис. 5.).

    Факт наличия клеток, включенных в митотический цикл в патологически измененной ткани эндотелия, согласуется с данными других исследовательских групп, занимающихся проблемами регенерации эндотелия [4, 24].

    Мы наблюдаем распластывание и значительное увеличение размеров клеток в эндотелии после ПКТ.

    Многие клетки имеют 2 или 3 ядра, чего не наблюдается в норме. Такая морфология может говорить о том, что мы наблюдаем компенсаторный процесс полиплоидизации.

    В научной литературе данное явление имеет название wound-induced polyploidization (WIP) и описано в т.ч. для роговичного эндотелия [25].

    Такая защитная реакция позволяет клеткам повысить свою функциональность и до какой-то степени справиться с поддержанием функции органа. Однако для его реализации, как и для запуска митоза, видимо, требуется определенный стимулирующий сигнал, которым могло явиться проведение ПКТ – введение в переднюю камеру клеточного препарата, содержащего «коктейль» ростовых факторов.

    Заключение

    Проведенные лабораторные исследования метода персонализированной клеточной терапии говорят о том, что в основе его лежит пролонгированное (за счет продолжающегося в передней камере синтеза введенными клетками крови) стимулирующее действие коктейля ростовых факторов и цитокинов на поврежденный эндотелий, что повышает его компенсаторные способности.


Страница источника: 93-97


«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конфере...

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «В...

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференцияПироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практ...

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании...

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3DСложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеоси...

«Живая хирургия» компании «НанОптика»«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракци...

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО