Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:УДК 617.713

DOI:https://doi.org/10.25276/2410-1257-2019-1-93-97

Лабораторные исследования механизмов персонализированной клеточной терапии поражений эндотелия роговицы в ФГБНУ «НИИГБ»


     Одними из наиболее тяжелых поражений роговицы являются те, при которых страдает задний эпителий роговицы (эндотелий). Терапевтических подходов к лечению таких состояний мало, поэтому привлекают внимание оригинальные методы воздействия на пораженный участок. Так, в НИИ ГБ разработан метод минимально-инвазивного воздействия на поврежденную роговицу – введение в переднюю камеру суспензии активированных лейкоцитов в процессированной сыворотке крови – персонализированная клеточная терапия (ПКТ). Проведенные клинические исследования метода ПКТ свидетельствуют о его безопасности и терапевтической эффективности в офтальмологической клинике для лечения ранней ПБК и герпесвирусного кератоиридоциклита и эндотелиита [1]. Однако, задача расшифровки механизма действия ПКТ не решена до конца, т.к. на живом глазу пациента мы не можем увидеть молекулярную картину происходящих процессов, а моделирование in vitro не способно воссоздать всю полноту взаимодействий, происходящих in vivo.

    В настоящем обзоре систематизированы результаты лабораторных исследований, связанных с изучением метода ПКТ, полученные в ФГБНУ НИИГБ на протяжении нескольких десятков лет.

    На первых этапах изучение механизма действия ПКТ было направлено на детальную характеристику вводимых субстанций, изучение эффектов стимулятора на клетки крови, анализ клеточного и цитокинового состава вводимого препарата, корреляцию с клиническим эффектом.

    Что же обуславливает эффективность ПКТ? Оригинальная методика выделения клеток позволяет получить из небольшого объёма периферической крови пациента клеточный препарат (КП), представляющий из себя взвесь аутологичных лейкоцитов в насыщенной цитокинами (процессированной) сыворотке. Она описана в публикациях авторского коллектива, работавшего над его созданием [2].

    Для получения КП сначала готовят раствор стимулятора – 200 ЕД препарата Полудан (ЗАО «Верофарм», РФ) в 2,0 мл воды для инъекций в стерильной пробирке на 10 мл. Из локтевой вены в пробирку с раствором набирают 8 мл крови. Затем раствор инкубируют 4 часа при температуре 37°С. За это время происходит коагуляция крови, частичная ретракция фибринового сгустка, синтезируются цитокины.

    На следующем этапе выделяют КП путем центрифугирования пробирки со свернувшейся кровью в течение 10 минут при 3000 об/мин., после чего собирают образовавшуюся светлую полосу из лейкоцитарных клеток, обводя иглой шприца, диаметром 0,8 мм, вокруг фибринового сгустка. Вместе с лейкоцитами захватывается сыворотка и некоторое количество эритроцитов. Полученную клеточную суспензию переносят в другую стерильную пробирку и доводят концентрацию клеток до 3 млн/мл (рис. 1).

    Полученный КП представляет из себя взвесь лейкоцитов в процессированной аутологичной сыворотке.

    Введение клеток во время операции, когда нарушается биологическая герметичность тканевой ниши, зачастую позволяет значительно усилить лечебный эффект КТ. Такая манипуляция получила название «интраоперационная клеточная терапия» [3].

    Именно такая манипуляция проводится при осуществлении ПКТ – водянистая влага передней камеры глаза заменяется на КП. Тем самым изменяется микроокружение эндотелиоцитов. Что же является терапевтически эффективным элементом в данном случае?

    Логично предположить, что можно воздействовать на патологический процесс через субстанции, вовлеченные в его регулирование в норме. В нашем случае самое уязвимое звено физиологической системы роговицы это низкая способность эндотелия роговицы взрослого человека к регенерации. И в данном случае необходимо снимать контактное ингибирование деления и нивелировать дисбаланс ростовых факторов, приводящий к «аресту» клетки в нерепликативной фазе [4, 5].

    Источником ростовых факторов и цитокинов в организме являются синтетически активные клетки, в том числе клетки крови. Вкупе с легкостью получения, компоненты крови являются удобным материалом для лечебного воздействия, т.е. введения больному живых клеток – клеточной терапии – КТ (с целью регенерации поврежденной ткани).

    Персонализированная же клеточная терапия подразумевает в т.ч. использование для лечения пациента его собственных клеток, интактных или каким-либо образом обработанных [6, 7].

    Принято считать, что механизмами, обусловливающими эффективность любой КТ, являются: а) заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая её функцию, и б) трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [8, 9]. Трансдифференцировка введенных клеток крови в поврежденный эндотелий роговицы вряд ли возможна, поэтому мы рассматривали трофический механизм действия как основной.

    В состав КП для ПКТ входят несколько важных компонентов: клетки крови – лейкоциты и эритроциты и процессированная сыворотка, в состав которой входят собственно сывороточные компоненты, раствор стимулятора – поли А:У и цитокины, синтезированные клетками крови за время инкубации.

    Нужно отметить, что состав используемой сыворотки принципиально отличается от свежеполученной нативной сыворотки, используемой в диагностических целях, и тем более от плазмы крови.

    При приготовлении КП используется синтетический комплекс полиадениловой-полиуридиловой кислот, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3 и 7 типа [10]. В диссертации Каспаровой Евг.А. описаны результаты огромной работы нескольких исследовательских коллективов и подробно описываются эффекты полудана [11]. Показано, что при инъекционном пути введения поли А:У сывороточный уровень интерферона повышается до 110 МЕ/мл.

    Исследования реакции лейкоцитов in vitro также свидетельствуют о том, что полудан стимулирует образование в высоких титрах всех трех видов интерферона –α, βи γ.

    Также была определена динамика интерферонообразования в разных фракциях крови. Для этого гепаринизированную венозную кровь разделяли центрифугированием на плазму, лейкомассу и эритроциты и оценивали содержание a и g интерферонов через каждые через 30 минут после стимуляции(рис. 2).

    Установлено, что интерферонообразование начинается сразу же после добавления препарата, достигая максимума через 1,5 часа. Наибольшие титры интерферонов ожидаемо были отмечены в лейкоцитарной фракции. Показано, что основной мишенью полудана в плане выработки интерферонов являются лейкоциты, а для накопления синтезированных цитокинов требуется как минимум 1,5 часа.

     Далее было исследовано влияние полудана на функциональное состояние клеток. Для этого оценивались пролиферация и апоптоз мононуклеарных клеток (МНК) здоровых доноров [12]. Для этого к МНК в присутствии ФГА (10мкг/мл) или декcаметазона (0,001мкг/мл) добавляли раствор полудана в дозах от 0,0001 до 1,0 МЕ/мл. Пролиферативная активность оценивалась по включению изотопа 3Н тимидина, апоптоз определяли на проточном цитофлюориметре по проценту окрашенных пропидий-йодидом клеток.

    Отмечено, что под влиянием полудана отмечаются два дозозависимых эффекта: индекс стимуляции пролиферации увеличивается и одновременно снижается уровень апоптоза.

    Следующим этапом изучения методики стала диссертационная работа Суббот А.М., посвященная исследованию клеточного и цитокинового состава КП [13].

    Оценку содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов и их субпопуляций в КП проводили путем микроскопического исследования КП, окрашенных по Романовскому – Гимзе и на проточном цитофлюориметре BDFACSAria (BDbiosciences, США) по параметрам светорассеяния и по иммуноцитохимическому окрашиванию.

    В результате, было показано, в состав клеточного препарата для ПКТ входят гранулоциты, моноциты и лимфоциты, при этом доля гранулоцитарной фракции увеличена по сравнению с кровью в 1,5 раза, соотношение Т-хелперов, Т-цитотоксических, NK-клеток соответствует их содержанию в крови, а содержание В-лимфоцитов по сравнению с кровью снижено на 80% [14].

    Активными регуляторами межклеточных взаимодействий являются цитокины и факторы роста, поэтому важной частью проделанной работы было их определение в КП(табл.).

    Содержание этих субстанций определяли методом иммуноферментного анализа в группах: стимулированных полуданом и контрольных КП. Для выяснения внутриклеточного содержания цитокинов проводилось их определение в образцах, где клетки были разрушены. Также для сравнения определялась концентрация цитокинов в сыворотке и плазме.

    Определяли концентрацию провоспалительных (ИЛ-1, -2, -6, -8, ФНО-α, ИФ-α, -γ), противовоспалительных (ИЛ-4, -10) и иммунорегуляторных (ИЛ-17) цитокинов, а также факторов роста, регулирующих функции клеток эндотелия роговицы (TGF-β1, TGF-β2, b-FGF, PDGF-AB, VEGF).

    Установлено что цитокиновый профиль КП формируется за счет нескольких пулов цитокинов (рис. 3): выделенных в ответ на стимуляцию поли А:У (ИФ-α, ИЛ-1,-6, ФНО-α); спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8); предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGF-β1, PDGF-AB, TGF-β2, VEGF, ИФ-γи ИЛ-4) [15].

    Изучение культуры МНК показало, что эти клетки отвечают на добавление в культуру поли A:У усилением синтеза ИФ-γ. На уровень ИЛ-4 и ФНО-αвнесение поли А:У не влияет. Отсутствие значимого увеличения содержания ФНО-α в культуре МНК при добавлении поли А:У даже через 24 часа свидетельствует о том, что источником этого цитокина в КП служат клетки гранулоцитарного ряда, а не МНК [16].

    Концентрация ИФ-γ, зарегистрированная в стимулированной культуре через 24 часа (193 пг/мл), на порядок превышает измеренную в КП (10,8 пг/мл). Можно предположить, что такая же ситуация наблюдается после введения КП в переднюю камеру, МНК в составе КП, продолжают синтезировать ИФ-γи увеличивают его концентрацию в водянистой влаге, что помогает в борьбе с вирусной инфекцией при герпетической природе поражения эндотелия.

    Концентрации TGF-β1, PDGF-AB и VEGF в КП на порядок превышают их физиологические концентрации в водянистой влаге передней камеры глаза, обеспечивающие в норме нерепликативное состояние эндотелиоцитов. Наличие широкого спектра цитокинов и факторов роста в составе сывороточной части КП позволяет рассматривать её в качестве отдельного терапевтического инструмента.

    Можно предположить, что при проведении ПКТ наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов рядом авторов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGF-β1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения [17-20]. Провоспалительные цитокины также участвуют в процессах регенерации – ФНО-αрегулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами [21, 22].

    Кроме того, провоспалительные цитокины ослабляют контакты между эндотелиоцитами, снимая один из механизмов ингибирования митоза [23]. Все это, вероятно, и приводит к наблюдаемому эффекту – восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы.

    Результаты определения клеточного состава и цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис. 4).

     Анализ цитокинового профиля КП обнаружил высокую концентрацию провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1 в сывороточной части КП у больных, хорошо отвечающих на проводимую ПКТ.

    Высокий уровень провоспалительных цитокинов, как правило, рассматривают в негативном ключе, т.к. концентрация этих веществ в жидких средах глаза неизбежно повышается в развитой стадии воспалительного процесса и отчасти является маркером тяжести заболевания. Однако, эффекты, опосредуемые цитокинами, могут сыграть и положительную роль в процессах регенерации, потому что провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, снимая тем самым один из механизмов ингибирования митоза.

    Корреляционный анализ по методу Спирмена показал, что результат лечения находится в умеренной прямой связи с концентрацией в клеточном препарате ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1.

    Полученные результаты согласуются с предложенной нами теорией о механизме действия клеточного препарата, реализующего свой эффект, в частности, за счет ослабления межклеточных связей, что позволяет клеткам заднего эпителия роговицы поделиться, или, как минимум, увеличивает их способность мигрировать и закрыть зону дефекта.

    Это предположение подтверждают иммуногистохимические исследования, показавшие более выраженное наличие маркера пролиферации ki-67 в образцах эндотелиальных лоскутов роговицы пациентов. Образцы получены в ходе операции задней послойной кератопластики у пациентов, применение ПКТ у которых не привело к значительному улучшению зрения, по сравнению с группой, в которой оперативное вмешательство проводилось по поводу буллезной кератопатии без проведения ПКТ. Кроме того, в образцах после ПКТ наблюдалось хорошее равномерное окрашивание белков плотных контактов ZO-1 (рис. 5.).

    Факт наличия клеток, включенных в митотический цикл в патологически измененной ткани эндотелия, согласуется с данными других исследовательских групп, занимающихся проблемами регенерации эндотелия [4, 24].

    Мы наблюдаем распластывание и значительное увеличение размеров клеток в эндотелии после ПКТ.

    Многие клетки имеют 2 или 3 ядра, чего не наблюдается в норме. Такая морфология может говорить о том, что мы наблюдаем компенсаторный процесс полиплоидизации.

    В научной литературе данное явление имеет название wound-induced polyploidization (WIP) и описано в т.ч. для роговичного эндотелия [25].

    Такая защитная реакция позволяет клеткам повысить свою функциональность и до какой-то степени справиться с поддержанием функции органа. Однако для его реализации, как и для запуска митоза, видимо, требуется определенный стимулирующий сигнал, которым могло явиться проведение ПКТ – введение в переднюю камеру клеточного препарата, содержащего «коктейль» ростовых факторов.

    Заключение

    Проведенные лабораторные исследования метода персонализированной клеточной терапии говорят о том, что в основе его лежит пролонгированное (за счет продолжающегося в передней камере синтеза введенными клетками крови) стимулирующее действие коктейля ростовых факторов и цитокинов на поврежденный эндотелий, что повышает его компенсаторные способности.


Страница источника: 93-97

Просмотров: 418