Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Сателлитные симпозиумы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Онлайн семинар

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Онлайн семинар

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Сателлитные симпозиумы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Онлайн семинар

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Онлайн семинар

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Все видео...

Заключение


    Совершенствование технологий направленных на лечение дегенеративно-дистрофических заболеваний фиброзной оболочки глазного яблока имеет не только большое научное, но и медицинское значение в виду высокой частоты данных нарушений и отсутствия тенденции к их снижению [116, 117, 125, 205, 374, 409]. Эктазии и стафиломы склеры, формирующиеся на рубцово-измененных и истонченных её участках в результате предшествующих травм или воспалительного процесса [15], а также задняя стафилома склеры при миопии высокой степени, приводящая к изменениями глазного дна, до сих пор занимают одно из ведущих мест среди инвалидности по зрению лиц трудоспособного возраста [118, 181, 217, 284, 438].

    Широко применяемые общепринятые бандажирующие методики для «наружного» укрепления склеры с использованием макроскопических аллопластических имплантатов, укладываемых на фиброзную оболочку глазного яблока [52, 90, 91, 145, 164, 176, 223, 239, 291, 307, 401, 402], способствуют формированию новообразованной соединительной ткани только на её поверхности [11, 391]. При этом брефоткани человека, такие как плацента, пуповина и амнион, имеют преимущества по ускорению регенерацию тканей реципиента в процессе своего рассасывания и активно стимулируют процессы репарации и васкуляризации в зонах повреждения [20, 64, 123, 160, 164, 269, 312, 313, 379, 423, 444]. Однако из-за отсутствия проникновения макроскопических аллопластических имплантатов в глубину склеры интрамуральная регенерация самой фиброзной оболочки не наблюдается [132] вследствие низких в ней фибропластических процессов [352, 432]. Для того чтобы добиться максимального стимулирования интрамуральной регенерации собственного вещества истонченной склеры, необходимой для её укрепления, нужно было разработать технологию создания нанодисперсного биологического материала, способного проникать за счёт своих малых размеров в строму фиброзной оболочки глаза, а также имплантата на его основе для введения экстрабульбарно и саму методику имплантации полученного изделия.

    Целью данного исследования явилась разработка технологии изготовления биоимплантата на основе фрагмента пуповины и нанодисперсной плаценты и изучение закономерностей регенеративных процессов при имплантации изделия в эксперименте для усиления прочностных свойств склеры при её заболеваниях. Для достижения цели были сформулированы задачи: разработать методику изготовления нанодисперсной плаценты методом механоактивации и изучить биофизические свойства и структуру полученной нанодисперсной плаценты; разработать технологию имплантации нанодисперсной плаценты и методику изготовления биоимплантата на основе фрагмента пуповины и нанодисперсной плаценты для экстрабульбарного введения в эксперименте; определить оптимальные способы и объёмы введения нанодисперсной плаценты в эксперименте; изучить биологические эффекты и глубину распространения нанодисперсной плаценты в тканях глаза экспериментальных животных при имплантации изделия; разработать методику оценки степени зрелости коллагенового волокна как маркёра пролиферативной активности соединительной ткани на основе изучения показателя механической жёсткости коллагеновых волокон и степени организации их поперечной D-периодичности; оценить степень трофического обеспечения тканей глаза экспериментальных животных при имплантации изделия; изучить морфологические механизмы регенеративных процессов в тканях глаза экспериментальных животных при имплантации нанодисперсной плаценты; изучить биомеханические характеристики склеры экспериментальных животных при имплантации изделия.

    Несмотря на то, что метод механоактивации в шаровой планетарной мельнице для изменения первоначального агрегатного состояния вещества с переходом его в наноразмерный уровень в настоящее время активно используется и в медицине в частности для создания новых лекарственных препаратов или модификации используемых с целью повышения их терапевтических свойств [39, 41, 127, 128, 247, 292], получения нанодисперсных порошков в качестве носителей биологически активных веществ [420], при обзоре литературы по данной теме работ по применению метода для создания нанодисперсных биологических материалов найдено не было.

    Для выполнения поставленной цели работы по разработке технологии изготовления биоимплантата на основе фрагмента пуповины и нанодисперсной плаценты и изучение закономерностей регенеративных процессов в склере при имплантации изделия в эксперименте и решению задач по её достижению исследование было поделено на 2 этапа: предварительный этап, состоящий из первой и второй серии опытов, и основной этап, состоящий из трёх серий опытов.

    В начале до выполнения двух этапов исследований проведена разработка методики получения нанодисперсной плаценты, оценка её структуры и физико-химических свойств. Производили механоактивацию предварительно лиофильновысушенной и крупноизмельчённой плаценты человека в шаровой планетарной мельнице «Pulverezette 7» (Fritsch, Германия) при температуре не более 60 ° С и величины подведенной удельной энергии менее 15 кДж/г в течение 60 минут (патент № 2367448 от 20.09.09 г.). Установили, что в процессе механоактивации лиофилизированной плаценты человека в шаровой планетарной мельнице происходит разрушение как межмолекулярных, так и внутримолекулярных связей белковых молекул с формированием отдельных полипептидных цепочек молекулы тропоколлагена свёрнутой в пространстве в виде зерна и имеющую размеры от 40 до 100 нм. При этом размер зёрен плаценты был чуть меньшим, чем размер пор в склере глаза, который равен 100-200 нм [391], что предполагало их дальнейшее проникновение в глубину склеры.

    Зёрна полученного ультрадисперсного порошка плаценты за счет физической адгезии связывались между собой с образованием частиц размером от 200 до 500 нм, которые в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм. Такой микрометровый размер агломерата предполагал клеточный ответ при введении порошка нанодисперсной плаценты в ткани реципиента, являющийся, по мнению ряда авторов [143, 144], индуктором репаративных процессов. Процесс механоактивации разрушал водородные связи плаценты с освобождением большого количества ионов водорода в полипептидных цепочках молекулы коллагена. Это объясняло повышенную гидрофильность нанодисперсной плаценты в сравнении с исходным образцом вследствие активного взаимодействия с ионами гидроксида (OH–) воды, что также предполагало более быстрое взаимодействие с тканями реципиента при имплантации и способствовало проникновению в глубокие слои собственного вещества склеры диффузионным способом. При этом показатели липофильности оставались исходными, что, по мнению ряда авторов, не влияет на способность биологического материала проникать в ткани реципиента [391].

    После получения порошка плаценты ультрадисперсной структуры производилась разработка технологии изготовления биоимплантата на основе фрагмента пуповины и нанодисперсной плаценты для эпибульбарного введения. Для этого фрагмент пуповины, представленный отрезком её сосуда, наполняли порошком нанодисперсной плаценты. Концы биоимплантата завязывали биологической нитью. При этом получался биоимплантат размерами (10,0 ± 1,0) × (2,0 ± 0,5) мм (патент № 2369361 от 10.10.09 г.). Консервировали такое изделие в 0,2 % спиртовом растворе тимола, содержащего хлорид лития по отработанной ранее методике для консервации и хранения аллопластических материалов [72]. Также была разработана технология введения нанодисперсной плаценты инъекционным способом через иглу 29 G в виде суспензии.

    Были проведены две серии предварительного этапа экспериментальных исследований на крысах с целью оценки реакций тканей глаза на введение разработанного биоимплантата, а также определение оптимального объёма (дозы) нанодисперсной плаценты для стимулирования необходимых биологических эффектов в зоне введения. Было определено, что нанодисперсная плацента проникала в интактную склеру животного, вызывала коллагеногенез как в собственном веществе склеры, так и на её поверхности. А оптимальный объём введения нанодисперсной плаценты соответствовал количеству 5 мг сухого вещества.

    На основном этапе экспериментальных исследований производилась оценка биологических эффектов и морфологических механизмов регенеративных процессов в тканях глаза опытных животных при введении биоимплантата с нанодисперсной плацентой и определения глубины её проникновения в склеру. Для этого было проведено несколько серий исследований. В первой серии основного этапа экспериментальное исследование выполнялось на кроликах (4 группы, n = 72). Первая опытная группа (n = 18) – разрез конъюнктивы глаза животного в верхне-наружнем квадранте в 3-4 мм от лимба, введение под конъюнктиву на склеру биоимплантата на основе фрагмента сосуда пуповины, заполненного нанодисперсной плацентой. Вторая опытная группа (n = 18) – аналогичный разрез конъюнктивы глаза животного, имплантация биоимплантата с крупнодисперсной плацентой (исходной, до механоактивации). Первая контрольная группа (n = 18) – введение биоимплантата, представленного фрагментом пуповины, без его предварительного наполнения. Вторая контрольная группа (n = 18) – разрез конъюнктивы без введения биоимплантата. Морфологические исследования тканей глазного яблока животных выполняли через 3, 7, 14, 30, 60 и 90 суток после имплантации. Парафиновые срезы при этом изучались общегистологичекими методами и сканирующей зондовой лабораторией ИНТЕГРА Прима (НТ-МДТ, Россия), глубину проникновения нанодисперсной плаценты в ткани реципиента исследовали при помощи конфокальной микроскопии и флуоресцентной спектроскопии на ИНТЕГРА Спектра (НТ-МДТ, Россия) в режимах спектрального анализа и флуоресцентного сканирования. Оценивалось также трофическое обеспечение тканей зоны имплантации, как фактора активности протекания биологических реакций, путём определения удельной длины сосудов на единицу объёма, а также подсчитывали количество сосудов в поле зрения равном 0,01 мм² , диаметр сосуда и площадь сечения [6, 8, 12, 27, 32, 33, 253, 259]. Реакцию клеток мезенхимальной ткани изучаемой зоны исследовали иммуногистохимическим маркером – виментином, который прикрепляется к ядру, эндоплазматическому ретикулуму и митохондриям и обеспечивает прочность клеток и их устойчивость к механическому стрессу [272, 358, 446, 462].

    В процессе исследования выяснено, что за весь период наблюдения у животных второй опытной и обеих контрольной все процессы протекали только в зоне хирургического вмешательства на поверхности подлежащей склеры, без участия собственного вещества склеры. При этом более выраженные реакции наблюдались в группе животных при введение биоимплантата с крупнодисперсной плацентой. Реакции были аналогичные по описанию как у других авторов [92, 111, 144]. Применение лазерной конфокальной микроскопии в сочетании с методами комбинационного рассеяния и флуоресцентной микроскопией в биологических исследованиях [243, 323], с использованием спектральных характеристик объектов, зависимых от их молекулярной и макромолекулярной организации, позволило оценить глубину проникновения наночастиц плаценты в первой опытной группе при введении биоимплантата с нанодисперсной плацентой в глубокие слои склеры на ⅔ её глубины, с инфильтрацией данной зоны собственного вещества склеры иммунокомпетентными клетками и индуцированием коллагенообразования. По оценке механической жёсткости и степени разрешённости поперечной D-исчерченности методом атомно-силовой микроскопии изучалась степень зрелости коллагенового волокна (патент № 2446398 от 27.03.12 г.). Доказано формирование новых коллагеновых волокон на 1 месяце исследования в процентном отношении (29 % незрелых к 71 % зрелых), и завершение процессов ремоделирования к концу третьего месяца наблюдения в склере подлежащей зоне хирургического вмешательства. При исследовании зоны имплантации иммуногистохимически с помощью виментина отмечено, что введение биоимплантата с нанодисперсной плацентой в первой опытной группе приводило к реакции соединительной ткани глаза с активным участием клеток мезенхимального происходения – лейкоцитов в ранние сроки, фибробластов и эндотелиоцитов в более поздние сроки, что косвенно указывало на активность репаративных процессов данной зоны. При этом описанные реакции соединительнотканных структур глаза реципиента превосходили по активности реакции при введении биоимплантата с крупнодисперсной плацентой и, тем более, при имплантации фрагмента отрезка сосуда пуповины. При изучении трофического обеспечении зоны вмешательства не отмечалась достоверная разница в случае применения биоимплантатов с нанодисперсной плацентой и крупнодисперсным аналогом, что, на наш взгляд, было связано с реакцией соединительнотканных структур глаза лабораторного животного на введение биологического материала плацентарной природы происхождения не зависимо от его размерности, так как химический состав плаценты (до и после механоактивации) оставался неизменным.

    Во второй серии основного этапа экспериментального исследования производилась оценка степени репаративной активности соединительнотканных структур глаза в зоне имплантации биоимплантата с нанодисперсной плацентой. Для этого исследования проводили на крысах с применением иммуногистохимических исселедований. Выраженность процессов репарации оценивали по уровню пролиферативной и апоптотической активности, при этом использовали специфический маркер митозов – Ki-67 и маркер необратимого апоптоза – Caspasa-3. При этом индекс пролиферации высчитывался как процентное отношение количества пролиферирующих клеток (Ki-67+-клетки) к общему количеству клеток соединительной ткани глаза крысы на площади 0,01 мм² . Индекс апоптотической активности рассчитывался как процентное отношение количества клеток, находящихся в состоянии апоптоза, к 100 клеткам соединительной ткани глаза крысы. По аналогии с кроликами было взято 4 группы животных (n = 80): первая опытная группа (n = 20) – имплантация биоимплантата с нанодисперсной плацентой; вторая опытная группа (n = 20) – аналогичная имплантация изделия с крупноизмельчённой плацентой; первая контрольная группа (n = 20) – имплантация изделия без предварительного заполнения его биологическим материалом; вторая контрольная группа (n = 20) – ложнооперированные. Морфологические исследования производили через 3, 7, 30 и 60 суток после манипуляций. В ходе исследования было выяснено, что нанодисперсная плацента значительно усиливает процессы пролиферации в соединительнотканных структурах реципиента и повышает регенеративные свойства склеры в зоне введения, несмотря на её изначально низкую пролиферативную активность. При этом пролиферативная активность соединительной ткани в зоне имплантации биоимплантата с нанодисперсной плацентой в первой опытной группе была выше на 11,2 % чем во второй опытной группе при имплантации биоимплантата с крупнодисперсной плацентой, на 15,2 % выше, чем в первой контрольной группе при введении отрезка сосуда пуповины и на 24 % выше, чем при выполнении разреза конъюнктивы глаза крысы во второй контрольной группе.

    Во второй серии основного этапа экспериментального исследования производилась оценка репаративной активности соединительнотканных структур глаза в зависимости от объёмов введенной нанодисперсной плаценты. Для этого экспериментальные исследования производили на крысах (n = 80). Первоначально приготовляли суспензию нанодисперсной плаценты, смешивая её порошок (сухое вещество) с 0,08 ± 0,01 мл физиологического раствора (0,9 % раствор натрия хлорида). Ведение суспензии производилось в верхне-наружном квадранте глазного яблока под конъюнктиву с помощью иглы диаметром 0,3 мм (29 G). В первой опытной группе (n = 20) применяли суспензию из расчета 5 мг сухого вещества. Во второй опытной группе (n = 20) – 15 мг сухого вещества. В третьей опытной группе (n = 20) – 25 мг сухого вещества. Животным четвёртой группы (n = 20, контроль) вводили под конъюнктиву физиологический раствор в объёме 0,08 ± 0,01 мл. Изучены группы животных к концу 3, 7, 14 и 30 суток после манипуляций. Гистологические препараты приготовлялись стандартно и изучались общегистологическими методами. В результате исследования было выяснено, что увеличение дозы вводимого в ткани реципиента сухого вещества нанодисперсной плаценты прямопропоционально усиливает клеточный ответ соединительнотканной структуры конъюнктивы глаза крысы. Оптимальной в данной ситуации следует считать дозу вводимого сухого вещества нанодисперсной плаценты равной 5 мг, так как достоверно значимо усиливается клеточный ответ соединительнотканных структур конъюнктивы глаза крысы, а негативного (избыточного) ответа не наблюдается.

    В третьей серии основного этапа исследования производилась оценка биомеханических характеристик склеры опытных животных при введении биоимплантата с нанодисперсной плацентой эпибульбарно. Для биомеханического тестирования применялись методы исследования изолированной склеры кролика (n = 36). Для этого изучалась склера из каждой группы животных исследуемых в третьем этапе работы к концу 30, 60 и 90-х суток после имплантации изделия. Биомеханические испытания образцов склеральной ткани проводили в режиме однократного нагружения с целью получения таких показателей, как предел прочности (ПП) и модуля Юнга (МЮ). С помощью микрохирургического лезвия вырезали образцы склеры шириной 5 мм в меридиане введения биоимплантата эпибульбарно. Для транспортировки фрагментов склеры в лабораторию для биомеханических испытаний использовалась среда Борзенка-Мороз для хранения роговицы. Исследования проводили на испытательной машине Инстрон-3322. Введение биоимплантата с нанодисперсной плацентой положительно сказывалось на упругих характеристиках склеральной ткани экспериментального животного. При этом достоверно улучшались как прочностные (предел прочности), так и упругие характеристики (модуль Юнга) склеры глаза животного в зоне введения биомплантата с нанодисперной плацентой в рассматриваемые сроки наблюдения. Полученные результаты демонстрировали высокую корреляционную связь в первой опытной группе с введением биоимплантата с нанодисперсной плацентой между прочностью склеры и модулем Юнга во всех сроках наблюдения. Всё это дополняло наши предположения об индуцировании частицами нанодисперсной плацентой в склеральной ткани процессов репарации в виде коллагенообразования с последующим ремоделированием. Тогда как во второй опытной группе при введении биомплантата с крупнодисперсной плацентой и в первой контрольной при введении фрагмента отрезка сосуда пуповины корреляционная связь также была высокой в первые сроки наблюдения, однако в отдаленном периоде (90-е сутки) связь уменьшилась до уровня средней. А показатели прочности склеры и её упругие характеристики были значительно ниже, чем при имплантации нанодисперсной плаценты.

    Таким образом, подводя итог анализу результатов выполненных предварительного и основного этапов экспериментального исследования, считаем возможным заключить, что разработанная технология изготовления биоимплантата на основе фрагмента пуповины и нанодисперсной плаценты является эффективным индуктором регенерративных процессов в интактной склере при имплантации изделия экстрабульбарно.


Страница источника: 253-262

Просмотров: 219