Онлайн доклады

Онлайн доклады

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Все видео...

Заключение


    В современной офтальмологии существует множество способов лечения ВМД, таких, как: метаболическая терапия биодобавками, витаминами и полипептидными комплексами, интравитреальное введение ингибиторов неоангиогенеза, фотодинамическая терапия, хирургическое удаление фибро-васкулярных мембран, транслокация макулы, а также сочетание вышеперечисленных методик. Однако, данные методики не всегда способствуют значимому улучшению зрительных функций, могут являться дорогостоящими, относительно часто сопровождаются осложнениями, а ВМД по-прежнему продолжает являться одной из ведущих причин необратимой слепоты во всем мире [1, 2, 6, 7, 11, 17, 25, 58, 129].

    Первичным звеном в патогенезе развития ВМД является дисфункция РПЭ. Поэтому, в последние 30 лет, перспективным методом лечения ВМД, находящемся на стыке фундаментальной и клинической офтальмологии, является субретинальная трансплантация РПЭ, позволяющая влиять на первопричину развития ВМД [4, 28, 48, 70, 108].

    При анализе доступных источников литературы было выявлено, что современные методики трансплантации РПЭ имеют ряд недостатков, связанных травматичностью вмешательства, высоким риском осложнений и трансформацией трансплантатов в мезенхимальную ткань. Все эти недостатки могут приводить к низкими функциональным и анатомическим результатам в послеоперационном периоде [3, 20, 43, 67, 74, 89, 96, 131]. Была выдвинута обоснованная гипотеза о том, что субретинальная трансплантация РПЭ в форме 3D клеточных сфероидов эндовитреальным доступом через ретинопунктурное отверстие позволит решить вышеперечисленные проблемы. В связи с необходимостью проведения доклинических исследований были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

    Целью исследования явилась разработка технологии предоперационной подготовки и техники трансплантации 3D клеточных сфероидов аллогенного РПЭ в опыте на животных (кролики).

    Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

    1. Разработать метод конструирования трансплантатов 3D клеточных сфероидов из аллогенного ретинального пигментного эпителия кроликов.

    2. Разработать хирургическую технику субретинальной трансплантации 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте in vivo.

    3. Провести морфологическое исследование внутриглазных оболочек кроликов после трансплантации 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия с помощью гистологического исследования.

    4. Провести клинико-морфологическое обоснование безопасности техники трансплантации 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия с помощью биомикроскопии, офтальмоскопии и ультразвукового (УЗ) В-сканирования.

    5. Изучить клинико-морфологическое состояние сетчатки кроликов после трансплантации 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия с помощью оптической когерентной томографии.

    6. Исследовать функциональное состояние нейросенсорной сетчатки кроликов после трансплантации 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия посредством электроретинографии.

    Исследование проводилось в два этапа – in vitro и in vivo, соответственно поставленным задачам.

    На первом этапе проводили выделение РПЭ из глазных яблок (n=20) кроликов-доноров, используя модифицированную технику препарирования глазного яблока «закрытого» типа – без вскрытия витреальной полости, с последующим 2D культивированием с использованием среды, содержащей: DMEM/F12 (78% – 1-я опытная группа; 88% – 2-я контрольная группа), FBS (20% – 1-я опытная группа; 10% – 2-я контрольная группа), Глутамакс (1%) и раствор антибиотиков (1%).

    Через 14 дней после начала культивирования было получено 8,71х10 6 клеток РПЭ 1-го пассажа в 1-й опытной группе и 2,29х10 6 во 2-й контрольной группе. Было доказано, что удвоенное количество ростовых факторов в питательной среде достоверно способствует ускорению митоза клеток РПЭ (р<0,05).

    Для подтверждения фенотипа полученных 2D клеточных культур проводили иммуноцитохимическое окрашивание эпителиальными маркерами PRE-65, ZO-1, цитокератином 8,18 и мезенхимальным маркером виментином.

    Проведенное исследование подтвердило эпителиальный фенотип исследуемых клеточных культур и доказало, что удвоенное количество ростовых факторов в питательной среде не способствует ЭМТ клеток РПЭ, что не подтвердило литературные данные [98]. Следовательно, 20%-я концентрация FBS в питательной среде для 2D культивирования РПЭ является приемлемой.

    Из полученных 2D культур РПЭ формировали 3D культуры с использованием 81-луночных агарозных планшетов в расчете 1000 клеток на 1 сфероид. Было выявлено, что полное формирование сфероидов РПЭ происходит в течение 7-и дней. Полученные сфероиды имели округлую и гладкую форму, и оставались таковыми на всех последующих сроках наблюдения. Средний диаметр сфероидов составил 88,8 ± 9,2 мкм, что является оптимальным для субретинальной трансплантации при помощи канюль минимально допустимого диаметра – 39G. Указанный диаметр для 3D сфероидов, сконструированных из 1000 клеток РПЭ, является сопоставимым с литературными данными [15].

    Для подтверждения фенотипа полученных сфероидов проводили иммуноцитохимическое окрашивание эпителиальными маркерами PRE-65, ZO-1, цитокератином 8, 18 и мезенхимальным маркером виментином. Проведенное исследование подтвердило эпителиальный фенотип полученных трехмерных клеточных культур вплоть до 30-х суток 3D культивирования. В связи с необходимостью транспортировки донорского материала была изучена жизнеспособность сфероидов после пребывания при температуре +4°С в течение 4-х часов. Оценка жизнеспособности осуществлялась путем изучения адгезивных свойств сфероидов и методом флуоресцентного окрашивания маркером «Live and Dead». Было выявлено сохранение жизнеспособности сфероидов вплоть до 7-х суток наблюдения. Таким образом, были определены оптимальные сроки предтрансплантационного культивирования 3D сфероидов РПЭ.

    Второй этап включил в себя трансплантацию полученных клеточных культур 30 кроликам породы «шиншилла» (30 глаз). Операции выполнялись под общим наркозом. Экспериментальные животные были разделены на 3 равные группы – 2 опытные и 1 контрольную. Всем кроликам проводили лимбальную перитомию, в 2 мм от лимба на 2, 8 и 10 часах устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела для входа эндовитреального инструментария и инфузионной системы. Фиксировали инфузионную систему, вводили световод, витреотом, выполняли витрэктомию с удалением центральных и задних отделах стекловидного тела.

    Далее канюлей 25G с острым кончиком 39G делали ретинопунктуру выше места центральной зоны сетчатки. Кроликам из 1-й и 2-й опытных групп субретинально вводили 3D сфероиды РПЭ в количестве 81 (10 глаз) и 162 (10 глаз) соответственно. Клеточные культуры трансплантировали в жидкой среде – 50 мкл стерильного физиологического раствора. Животным из контрольной группы субретинально вводили 50 мкл стерильного физиологического раствора. ЭЛК сетчатки вокруг ретинопунктурного отверстия не проводили.

    Операции заканчивали аспирацией жидкости из витреальной полости с последующей заменой на стерильный воздух и наложением швов на склеральные и конъюнктивальные разрезы.

    В послеоперационном периоде всем экспериментальным животным на 1, 3, 7, 10, 14, 20, 30, 60 и 90-е сутки проводили биомикроскопию, офтальмоскопию, фоторегистрацию переднего и заднего отрезков глаза, УЗ В-сканирование внутриглазных оболочек, ЭРГ, ОКТ сетчатки и гистологическое исследование энуклеированных глазных яблок.

    В 1-е сутки после оперативного вмешательства при биомикроскопии глаза у всех прооперированных кроликов были спокойны, отмечалась умеренная инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, швы конъюнктивы были адаптированы, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, влага передней камеры прозрачная, радужка спокойна, выраженных помутнений хрусталика не наблюдалось. Постепенно, в течение 10-и суток, глаза у всех кроликов успокаивались, швы рассасывались, оптические среды оставались прозрачными и позволяли беспрепятственно визуализировать детали глазного дна на все дальнейшие сроки наблюдения.

    При офтальмоскопии у всех кроликов визуализировали бледно-розовый ДЗН с четкими границами, в зоне субретинальной инъекции определялась локальная плоская ОС. Ретинопунктурное отверстие не визуализировали. На 3-и – 7-е сутки во всех случаях отмечалось прилегание оболочек, офтальмоскопическая картина у всех кроликов оставалась стабильной на последующих сроках наблюдения.

    По данным УЗ В-сканирования в 1-е сутки у всех кроликов визуализировали локальную плоскую ОС (1-я опытная группа – 0,34 ± 0,03 мм, 2-я опытная группа – 0,39 ± 0,03 мм, контрольная группа – 0,27 ± 0,02 мм) в зоне введения клеточных трансплантатов, уровень воздуха составлял ⅓ – ½ объема объема витреальной полости. На 3-и сутки у всех кроликов из опытных и контрольной групп визуализировали прилегание оболочек. Содержимое витреальной полости было акустически прозрачным, внутриглазные оболочки выглядели интактно. Дальнейшее проведение В-сканирования не выявило значимых изменений внутриглазных оболочек у всех кроликов.

    За норму электроретинографических показателей были приняты данные, полученные до оперативного вмешательства: амплитуда а-волны – 45,8 ± 4,2 мкВ, латентность – 18,2 ± 1,3 мс, и амплитуда b-волны – 86,3 ± 7,3 мкВ, латентность – 48,7 ± 1,2 мс. Полученные показатели дооперационной ЭРГ у кроликов являются сопоставимыми с литературными данными [22]. По данным электроретинографии на 1-е сутки после проведения оперативного вмешательства у всех кроликов отмечали снижение биоэлектрической активности сетчатки, связанное с операционной травмой (1-я опытная группа – амплитуда а-волны - 15,9 ± 1,8 мкВ, латентность - 19,5 ± 1,4 мс, амплитуда b-волны - 37,1 ± 4,2 мкВ, латентность - 49,4 ± 1,3 мс. 2-я опытная группа – амплитуда а-волны – 15,3 ± 1,9 мкВ, латентность - 19,8 ± 1,6 мс, амплитуда b-волны - 36,2 ± 4,5 мкВ, латентность - 49,9 ± 1,5 мс. Контрольная группа – амплитуда а-волны - 16,6 ± 1,7 мкВ, латентность - 18,7 ± 1,3 мс, амплитуда b-волны - 38,8 ± 3,5 мкВ, латентность - 48,4 ± 1,2 мс). Согласно литературным данным, такое снижение биоэлектрической активности нейросенсорной сетчатки в раннем послеоперационном периоде после трансплантации РПЭ является допустимым и свидетельствуют об умеренном повреждении сетчатки вследствие операционной травмы [22]. По мере увеличения сроков наблюдения функциональное сетчатки восстанавливалось и возвращалось к нормальным исходным значениям к 20-м суткам в 1-й опытной группе (амплитуда а-волны – 44,1 ± 4,1 мкВ, латентность – 18,9 ± 1,4 мс, амплитуда b-волны – 84,8 ± 7,7 мкВ, латентность – 48,7 ± 1,5 мс), 30-м суткам во 2-й опытной группе (амплитуда а-волны – 43,6 ± 3,9 мкВ, латентность – 18,8 ± 1,5 мс, амплитуда b-волны – 83,6 ± 7,2 мкВ, латентность – 49,5 ± 1,8 мс) и 14-м суткам в контрольной группе (амплитуда а-волны – 44,5 ± 4,1 мкВ, латентность – 18,7 ± 1,3 мс, амплитуда b-волны – 85,9 ± 7,4 мкВ, латентность – 49,2 ± 1,2 мс). В последующие сроки наблюдения электроретинографические показатели сетчатки у всех кроликов оставались стабильными, что свидетельствовало о незначительной реакции нейросенсорной сетчатки на использованную в работе хирургическую технику субретинальной трансплантации 3D сфероидов РПЭ.

    При проведении ОКТ сетчатки кроликам за норму толщины сетчатки были приняты показатели, полученные до проведения оперативного вмешательства в аналогичной зоне – 145 ± 5 мкм. Полученные показатели толщины сетчатки являются сопоставимыми с литературными данными [136].

    В 1-е сутки ОКТ картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных: в зоне оперативного вмешательства отмечали локальную плоскую ОС в зоне проведения оперативного вмешательства и отек сетчатки (1-я опытная группа – 302 ± 28 мкм, 2-я опытная группа – 332 ± 30 мкм, контрольная группа – 254 ± 21 мкм). В опытных группах также субретинально визуалировали округлые конгломераты, диаметром 60-90 мкм – предположительно сфероиды РПЭ, отмечали адгезию большинства трансплантатов к нативному РПЭ кроликов-реципиентов. На 3-и, 7-е и 10-е сутки в опытных группах субретинально также обнаруживали трансплантаты, адгезированные к РПЭ кроликов-реципиентов, по мере увеличения сроков наблюдения форма трансплантатов становилась овальной – т.е. отмечалось уплощение трансплантатов. По мере наблюдения в опытных группах сетчатка прилегала и отек сетчатки резорбировался. У кроликов из 1-й опытной группы на 7-е сутки визуализировали прилегание сетчатки, толщина сетчатки вернулась к исходным значениям к 14-м суткам и составила 143 ± 4 мкм. У кроликов из 2-й опытной группы прилегание сетчатки определяли на 10-е сутки, толщина сетчатки соответствовала дооперационным данным к 20-м суткам и составила 144 ± 5 мкм. У кроликов из опытной группы на 3-и сутки визуализировали прилегание сетчатки, к 10-м суткам толщина сетчатки соответствовала исходным значениям и составила 146 ± 5 мкм. В последующие сроки наблюдения во всех группах с помощью ОКТ не было выявлено значимых морфологических изменений сетчатки – отмечалось прилегание сетчатки, отек сетчатки не визуализировался, дегенеративных изменений фоторецепторов не наблюдалось ни в одном случае.

    Все описанные осложнения после трансплантации 3D сфероидов РПЭ (отек сетчатки, локальная ОС, снижение биоэлектрической активности нейросенсорной сетчатки) являются следствием операционной травмы, что соответствует данным литературы [56, 85, 132, 144]. Следует отметить, что во всех случаях трансплантации РПЭ в форме 3D сфероидов изменения всегда носили обратимый характер, что является преимуществом над методиками трансплантации РПЭ, описанными в литературном обзоре [33, 55, 121] и подтверждает микроинвазивность разработанной хирургической техники.

    При световой микроскопии гистологических срезов в течение всего срока наблюдения не было обнаружено патологических изменений внутриглазных структур. Склера имела нормальное строение без каких-либо изменений со стороны коллагеновых волокон. Роговица, радужка и цилиарное тело сохраняли нормальную структуру и целостность. В витреальной полости патологических клеточных элементов обнаружено не было. Во всех отделах на всех сроках исследования архитектоника сетчатки была сохранна: отсутствовали деструктивные изменения, не выявлено каких-либо признаков повреждения фоторецепторов, стратификация слоев не нарушена, пролиферативных изменений отмечено не было. Изменений в ДЗН и центральных сосудах сетчатки не наблюдалось. В 1-е сутки после проведения хирургического вмешательства на всех глазах опытных групп субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром 50-80 мкм, адгезированные к нативному РПЭ кроликов-реципиентов – предположительно 3D сфероиды РПЭ. Адгезия 3D сфероидов РПЭ является признаком жизнеспособности клеточных трансплантатов. Также в опытных и контрольной группах отмечалось утолщение сетчатки, что является естественной патофизиологической реакцией в ответ на операционную травму. На 1-е, 3-и и 7-е сутки на всех глазах опытных групп также субретинально были обнаружены трансплантаты, адгезированные к нативному РПЭ и имеющие тенденцию к уплощению, что свидетельствовало о начале процесса спрединга. Утолщение сетчатки по-прежнему сохранялось во всех группах. К 10-м суткам на всех глазах опытных и контрольной групп сетчатка выглядела практически интактно, дегенеративных изменений фоторецепторов не было обнаружено, отмечалось прилегание к сосудистой оболочке. Между сетчаткой и хориоидеей визуализировался монослой РПЭ. Таким образом, на микроскопическом уровне было показано, что сфероиды РПЭ, трансплантируемые субретинально по предложенной технологии, являются жизнеспособными, так как адгезируются к нативному РПЭ кроликов-реципиентов и по мере увеличения сроков наблюдения распластываются, что способствует образованию нового клеточного слоя РПЭ. Ни в одном случае 3D сфероиды РПЭ не были обнаружены в витреальной полости, что свидетельствует о том, что клеточные трансплантаты не диссеминируют в витреальную полость. Отсутствие структурных нарушений со стороны оболочек глаза и его внутренних сред является доказательством безопасности субретинальной трансплантации РПЭ в форме 3D клеточных сфероидов Таким образом, можно сделать заключение: предложенная технология выделения и культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D клеточных сфероидов позволяет сохранять эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается данными иммуноцитохимических исследований. Разработанная малоинвазивная хирургическая техника трансплантации 3D сфероидов РПЭ является малоинвазивной, малотравматичной и эффективной, что подтверждается данными ОКТ и гистологическими исследованиями. Осложнения, описываемые в раннем послеоперационном периоде (локальная плоская OС в зоне проведения оперативного вмешательства, отек сетчатки), являются биологически безопасными и обратимыми, что подтверждается данными ЭРГ.

    Предложенные методика трехмерного культивирования РПЭ и хирургическая техника его субретинальной трансплантации являются перспективными для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику для лечения форм ВМД, не поддающихся традиционным методикам лечения.


Страница источника: 110-119

Просмотров: 50