Рисунок 7 – Глаз кролика группы I в различные сроки после имплантации коллагенового имплантанта в строму роговицы: А – 14 дней; Б – 30 дней; В – 3 месяца; Г – 6 месяцев
Рисунок 8 – Глаз кролика группы II в различные сроки после введения в интактную роговицу коллагенового имплантата, содержащего 30 мкг rhВМР-2: А – 14 дней; Б – 30 дней; В – 3 месяца; Г – 6 месяцев
У кроликов группы II операцию проводили на бельмах, техника была модифицирована, детальное описание представлено в главе 2. Благодаря предложенной операции удалось формировать интрастромальные карманы в ожоговых бельмах, в условиях отсутствия прозрачности тканей.
Рисунок 9 – Роговица кролика группы I через 1 месяц после имплантации коллагенового имплантата без rhBMP-2: 1 – коллагеновый имплантат; 2 – новообразованный сосуд микроциркуляторного русла; 3 – полость. Окраска гематоксилином и эозином, х 100
Рисунок 10 – Срез роговицы кролика группы I через 3 месяца после имплантации коллагенового имплантата: 1 – имплантат; 2 – полость; 3 – коллагеновые волокна; 4 – новообразованные сосуды микроциркуляторного русла. Окраска гематоксилином и эозином, х 120
Таким образом, удалось добиться локальной доставки rhBMP-2 в составе коллагенового имплантата в ткани роговицы и ожогового бельма, обеспечить его воздействие на всю площадь, исключить риски воздействия фактора роста на нетаргетные ткани глаза. Результаты дальнейшей клинической картины обеих групп представлены далее.
Группа I с введением в интрастромальный карман имплантата без rhBMP-2
На первом этапе исследования клиническая картина регистрировалась ежедневно. В раннем послеоперационном периоде во всех 12 случаях отмечено наличие перикорнеальной инъекции и незначительного отека роговицы в области операционного шва, в остальных отделах роговица сохраняла прозрачность, влага передней камеры была прозрачная, передняя камера средней глубины, реакция зрачка на свет активная (Рисунок 7А). Отек был обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. На 14-е сутки после операции у 4 кроликов отек сохранялся, однако в значительной мере регрессировал, а перикорнеальная инъекция наблюдалась только в зоне хирургического разреза, где так же отмечен рост новообразованных сосудов (Рисунок 7Б), которые самопроизвольно запустевали к концу первого месяца наблюдения (Рисунки 7В). Дальнейшая клиническая картина была стабильной, роговица сохраняла прозрачность, признаков воспаления не наблюдалось (Рисунок 7Г).
Группа II с введением в интрастромальный карман обогащенного rhBMP-2 имплантата
Рисунок 11 – Роговица кролика группы I через 6 месяцев после имплантации коллагенового имплантата. 1 – имплантат; 2 – полость; 3 – отдельные волокна имплантата среди окружающей стромы роговицы. Окраска гематоксилином и эозином; А – х100, Б – х1000
Рисунок 12 – Срез с захватом радужки и цилиарного тела после введения в роговицу кролика группы I коллагенового имплантата: А – 1 месяц; Б – 6 месяцев. 1 – цилиарное тело; 2 – цилиарные отростки; 3 – радужная оболочка. Окраска гематоксилином и эозином, х 120
К концу первого месяца наблюдения у 10 кроликов сосуды достигали центральных отделов и проникали в зону помутнений (Рисунок 8Б), где в дальнейшем формировался своеобразный сосудистый «клубочек», у остальных особей сосуды достигли центра на 5 дней позже. Дальнейшая клиническая картина характеризовалась нарастанием неоваскуляризации и помутнением роговицы (Рисунок 8В). Признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. Начиная с середины 4-го месяца наблюдения, отмечается постепенный регресс неоваскуляризации, однако крупные и глубокие сосуды продолжали функционировать. К концу всего периода наблюдения (6 месяцев) отмечалось наличие интенсивного бельма 2-й категории и глубокой стромальной неоваскуляризации (Рисунок 8Г).
3.4.2. Результаты гистологического исследования
Группа I с введением коллагенового имплантата без rhBMP-2
Гистологическое исследование области имплантации было проведено через 1, 3 и 6 месяцев после операции. Во всех случаях роговица была относительно равномерной толщины с минимальными изменениями. Имплантат сохранялся на всём его протяжении, постепенно истончаясь и частично расщепляясь, интегрируясь с окружающей стромой по мере увеличения сроков наблюдения.
Рисунок 13 – Срез роговицы кролика группы II через 1 месяц после имплантации коллагенового имплантата с rhBMP-2: 1– имплантат с rhBMP-2; 2 – полость; 3 – новообразованные сосуды; 4 – нарушение упорядоченности хода пучков коллагеновых волокон; 5 – созревающая соединительная ткань с выраженной неоваскуляризацией; 6 – разрастания грануляционной ткани, проникающие в имплантат; 7 – эпителий; 8 – десцеметова мембрана с эндотелием. Окраска гематоксилином и эозином; А – х100; Б – х200
Рисунок 14 – Срез роговицы кролика группы II через 3 месяца после имплантации в строму коллагенового имплантата с rhBMP-2: 1 – имплантат; 2 – очаг врастания созревающей соединительной ткани; 3 – новообразованные сосуды; 4 – зрелая соединительная ткань; 5 – разнонаправленность коллагеновых волокон стромы; 6 – эпителий; 7 – десцеметова мембрана с эндотелием. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 120
В образцах через 3 месяца наблюдалась аналогичная морфологическая картина, однако значительно меньше был выражен отек стромы и более упорядочен ход ее коллагеновых волокон. Также выявлялись единичные новообразованные сосуды микроциркуляторного русла (Рисунок 10). К 6 месяцам наблюдения во всех образцах отёк стромы не наблюдался, имплантат был истончен и интегрирован с окружающими тканями, в большей части коллагеновые пучки ориентированы правильно (Рисунок 11А). При большем увеличении видно, что коллагеновые волокна имплантата отличаются по своему строению от коллагеновых волокон стромы роговицы и тесно переплетены с ними (Рисунок 11Б). Во всех образцах передний эпителий стратифицирован, однако толщина его шиповатого и поверхностного слоев несколько уменьшена. Десцеметова мембрана и задний эпителий (эндотелий) без изменений.
Во всех исследуемых образцах цилиарное тело, связки хрусталика и радужная оболочка оставались интактными, роста новообразованных сосудов и признаков воспаления не наблюдалось (Рисунок 12). Цилиарное тело исследуемых образцов представлено рыхлой соединительной тканью с умеренным числом сосудов и пучками гладких мышц, диффузно рассеянными меланоцитами. Поверхность цилиарных отростков и внутренний край цилиарного тела покрыты слоем меланоцитов.
Группа II с введением коллагенового имплантата c rhBMP-2
Рисунок 15 – Срез роговицы кролика группы II через 6 месяцев после имплантации в строму коллагенового имплантата с фактором роста rhBMP-2: 1 – имплантат; 2 – новообразованные сосуды; 3 – зрелая соединительная ткань; 4 – разнонаправленность коллагеновых волокон стромы; 5 – эпителий; 6 – десцеметова мембрана с эндотелием. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 120
Рисунок 16 – Срез с захватом радужки и цилиарного тела после введения в роговицу кролика группы II коллагенового имплантата, обогащенного rhBMP-2: А – 1 месяц; Б – 6 месяцев; 1 – цилиарное тело; 2 – цилиарные отростки; 3 – радужная оболочка. Окраска гематоксилином и эозином, х 120
В образцах через 1 месяц отек стромы был выражен несколько сильнее по сравнению с группой I (без rhBMP-2), особенно вокруг имплантата. Отмечается нарушение упорядоченности хода пучков коллагеновых волокон, а также очаговый рост грануляционной (незрелой молодой соединительной) ткани с новообразованными сосудами микроциркуляторного русла (Рисунок 13).
Количество новообразованных сосудов, как и клеток стромы, значительно выше по сравнению с группой I. Сосуды наблюдались не только вокруг имплантата (как при введении чистого коллагена), но также и в толще роговицы. Сам имплантат истончен, однако сохранялся на всём протяжении, местами в него проникали лимфоциты, макрофаги и фибробласты. Передняя пограничная (боуменова) и задняя (десцеметова) мембраны были без особенностей.
Через 3 месяца в образцах наблюдалось большее истончение имплантата, появление участков зрелой соединительной ткани и снижение общего отёка стромы. Обращает на себя внимание появление участков частичного замещения стромы молодой соединительной тканью на некотором отдалении от границ имплантата (Рисунок 14). В остальных местах, особенно в зоне его расщепления обнаруживались очаги врастания созревающей соединительной ткани и обилие клеток, предположительно фибробластов и макрофагов. Передняя пограничная (боуменова) мембрана неравномерной толщины и с извитым ходом. Задняя (десцеметова) мембрана, как и прилежащий к ней слой стромы (слой Дюа), сохранены в большей степени. Задний эпителий (эндотелий) не изменён.
К 6 месяцам наблюдения большая часть стромы роговицы замещалась молодой и местами зрелой (особенно выше имплантата) соединительной тканью с разнонаправленными пучками плотно упакованных коллагеновых волокон и множеством новообразованных полнокровных сосудов разного калибра.
Коллагеновый имплантат был значительно истончен, местами замещен и интегрирован с окружающей стромой (Рисунок 15). Передняя пограничная (боуменова) и задняя (десцеметова) мембраны имела волнистый ход, боуменова мембрана местами плохо прослеживалась.
Во всех исследуемых образцах цилиарное тело было представлено рыхлой соединительной тканью с умеренным числом сосудов и пучками гладких мышц, диффузно рассеянными меланоцитами. Поверхность связок хрусталика и внутренний край цилиарного тела были покрыты слоем меланоцитов. Очагов неоваскуляризации и признаков воспаления не наблюдалось (Рисунок 16).
