Онлайн доклады

Онлайн доклады

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Все видео...

2.3. Методы определения эффективности и безопасности пролонгированного применения селективных иммунодепрессантов in vitro


    В доступной на сегодняшний день литературе не опубликовано исследований по определению концентраций циклоспорина А и эверолимуса, оказывающих прямой антипролиферативный эффект на фибробласты теноновой капсулы человека – основных клеток, подвергающихся действию препаратов при выполнении гипотензивных вмешательств, что обусловило необходимость проведения данного этапа исследования.

    Серию экспериментальных исследований in vitro на культурах клеток проводили в соответствии со стандартом ISO 5 на базе лаборатории культур клеток биотехнологического центра «БиоТех» ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России в лаборатории культур клеток биотехнологического отдела, оснащенной комплексом «чистых помещений» класса Б с возможностью создания зон класса А.

    2.3.1. Методика получения первичных культур клеток

    В ходе выполнения данного этапа исследования была разработана технология получения первичных культур фибробластов из донорских образцов теноновой капсулы человека.

    Для получения первичных культур образцы теноновой капсулы человека (7 образцов, размер 2 × 2 мм) были изъяты у пациентов ГБУЗ СОКОБ им. Т.И. Ерошевского путем прижизненной биопсии во время выполнения хирургического лечения заболеваний глаз после получения добровольного информированного согласия и одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ и локальным этическим комитетом ГБУЗ СОКОБ им. Т.И. Ерошевского. Доноры ранее не подвергались хирургическому лечению офтальмологической патологии, не страдали хроническими инфекционными, онкологическими заболеваниями, сахарным диабетом, не получали гормональную терапию, цитостатики и другие лекарственные вещества, влияющие на пролиферативную активность клеток. Транспортировку донорского материала осуществляли в стерильном пенициллиновом флаконе, наполненном физиологическим раствором.

    Материал был извлечен из транспортировочного флакона стерильным пинцетом и перенесен в лабораторную чашку Петри со стерильным раствором Хенкса. Транспортировочный флакон со средой помещали в термостат на 24 часа для проведения теста на стерильность. Через 24 часа признаков контаминации и микробного обсеменения не было выявлено ни в одном случае.

    После трехкратной отмывки фрагментов теноновой капсулы от крови и слизи приступали к механическому измельчению материала. Отработанный раствор отбирали стерильными пипетками и проводили ферментативную обработку донорского материала раствором коллагеназы из поджелудочной железы краба 0,1% в течение 1 минуты. Инактивировали действие фермента стерильным раствором Версен 0,02% (реактивы ООО «Биолот», Россия).

    Клетки были получены по методике первичных эксплантатов, описанной К.Н. Гринбергом [25, 32], с использованием полной ростовой среды (среда 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот») и 40 мкг/мл гентамицина в СО2 –инкубаторе МСО-18АC (Sanyo – Incubator, MCO-18 A, Япония) при 5% СО2, температуре 37 °С и постоянной влажности. Обследование методом полимеразной цепной реакции показало отсутствие контаминации культуры инфекционными агентами, в том числе микоплазмами и цитомегаловирусом.

    2.3.2. Определение антипролиферативной активности и цитотоксичности циклоспорина А и эверолимуса

    Фибробласты теноновой капсулы человека высевали на дно лунок 96-луночных культуральных планшетов в дозе 2 × 104 клеток/см2 и культивировали в стандартных условиях с использованием полной ростовой среды. При достижении 80% конфлуентности монослоя из лунок отбирали культуральную среду и заменяли ее свежей, в состав которой вводили препарат.

    Для получения исследуемых питательных сред группы ЦсА в образцы добавляли концентрат данного препарата (Сандиммун, Novartis Pharma, Швейцария) до получения требуемых концентраций препарата: 0,05 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 2 мкг/мл.

    Для получения питательной среды с требуемой концентрацией эверолимуса, использовали его порошок (>95%, Sigma Aldrich, США), который предварительно разводили в 0,02 мл диметилсульфоксида (ДМСО) (ООО «Биолот», Россия) до получения следующих концентраций препарата в питательной среде: 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл и 20 мкг/мл.

    Планшеты помещали в СО2 - инкубатор при постоянной влажности и температуре. Культивирование производили в течение 7 дней.

    Группой контроля служила культура фибробластов теноновой капсулы человека в полной ростовой питательной среде без добавления лекарственных препаратов в эксперименте с ЦсА и без добавления препаратов, но с внесением 0,02 мл ДМСО в серии исследований с эверолимусом.

    В каждой серии эксперимента использовали по 5 повторов культур клеток для каждой группы.

    Ежедневно производили визуальную оценку и фоторегистрацию культуры с помощью аппаратно-программного комплекса (АПК) на основе инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония) при увеличении × 100 и × 200 с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония). Оценивали структурные особенности клеток и монослоя в целом, считали количество клеток на 1 мм2.

    По окончании эксперимента монослой окрашивали витальным красителем трипановым синим по стандартной методике с целью выявления клеток с поврежденными мембранами. Раствор трипанового синего не проникает через неповрежденные клеточные мембраны, поэтому окрашивание ядра в синий цвет свидетельствует о нарушении жизнеспособности клетки. Равномерно интенсивно окрашенные клетки считают нежизнеспособными. Для выявления внутриклеточных липидных включений и общей оценки структуры монослоя применяли гистологическую окраску суданом IV и гематоксилином Майера. С помощью окраски набором флуорофоров («Live/Dead Cell-Mediated Cytotoxicity Kit», Invitrogen, США) определяли жизнеспособные клетки, характеризовавшиеся зеленой флуоресценцией и поврежденные клетки с красной флуоресценцией ядер. Принцип действия флуоресцентных красителей аналогичен описанному выше: через неповрежденные мембраны живых клеток может проникнуть лишь компонент набора, характеризующийся зеленым свечением (DiOC18), в то время как второй компонент (пропидия йодид) проникает в клетку лишь при условии повреждения мембраны. В клетке пропидия йодид проникает в ядро, где связывается с ДНК, что и обусловливает красное свечение ядер поврежденных клеток. Анализ окрашенных препаратов, фоторегистрацию и морфометрию производили с помощью АПК на основе исследовательского микроскопа Olympus ВX41 («Olympus», Япония), с использованием программного обеспечения «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия) и CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония) при увеличении × 100, × 200 и × 400.

    Пролиферативную активность и жизнеспособность клеток характеризовали на основании следующих показателей: плотность монослоя, индекс пролиферации, время удвоения культуры, количество удвоений, доля поврежденных клеток в монослое, ядерно-цитоплазменное соотношение.

    Плотность монослоя (количество клеток на 1 мм2) считали в нативных препаратах с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония).

    Формулы, по которым производили расчет показателей, представлены ниже: Индекс пролиферации (PI): PI = Nt/N1, Время удвоения культуры (DT): DT = t x lg2/lg(Nt /N1), Количество удвоений культуры (PDL): PDL = (lg(Nt) - lg(N1))/lg2, где N1 – плотность клеток в монослое через 24 часа после посадки клеток, Nt – количество клеток монослоя на момент определения показателя, t – время роста культуры (часы).

    Ядерно-цитоплазменное отношение (ЯЦС): ЯЦС = SN/Sc, где SN – площадь ядра, Sc – площадь цитоплазмы.

    В окрашенных гематоксилином и суданом IV препаратах с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 определяли площадь клетки и её ядра (SN). Для получения площади цитоплазмы (Sc) из 1-го показателя вычитали 2-й.


Страница источника: 42-46

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:article47013
Просмотров: 602



Johnson & Johnson
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek