4.2. Определение антипролиферативной активности и цитотоксичности циклоспорина А

    4.2.1. Определение антипролиферативной активности циклоспорина А

     Исходное значение медианы плотности монослоя, определенное при подсчете количества клеток на 1 мм² через 24 часа после пересева до внесения препаратов в питательную среду, составило 172 кл/мм². Через 1 сутки после внесения ЦсА в культуральную среду значимых изменений характера монослоя отмечено не было. Клетки сохраняли хорошую адгезивную способность. Границы клеток оставались четкими, цитоплазма гомогенной. Ядра визуализировались. Клетки соединялись между собой с помощью 2-3 отростков, формируя равномерный монослой (Рисунок 14). Отмечали единичные клетки в фазе митоза. В концентрации 0,5 мкг/мл в монослое выявлены единичные округлые клетки с сохраненной адгезией ко дну культурального пластика. В более высоких концентрациях – 1,0 и 2,0 мкг/мл поврежденных клеток обнаружено не было. Через сутки культивирования в присутствии ЦсА наблюдали различия в плотности монослоя в исследуемых культурах. В некоторых группах происходило увеличение количества клеток, а в некоторых – незначительное уменьшение, что может быть связано с процессами адаптации клеток к новым условиям культивирования, которые проходили по-разному в исследуемых культурах вне зависимости от концентрации препарата. Так, в контрольной культуре и культурах с концентрацией ЦсА 0,5 и 1,0 мкг/мл плотность монослоя незначительно снижалась, в то время как в культурах с концентрацией препарата 0,05, 0,2 и 2,0 мкг/мл наблюдали медленную пролиферацию клеток (Рисунок 14). Фаза логарифмического роста для всех исследуемых культур наступала по прошествии 24 часов после внесения препарата и длилась 2 суток. Именно в данный промежуток времени оценивали пролиферативную активность фибробластов и влияние ЦсА на нее, а оценку плотности монослоя различных групп производили в динамике.

    Увеличение плотности монослоя за фазу логарифмического роста культур находилось в обратной зависимости от концентрации ЦсА в питательной среде с высокой силой связи по шкале Чеддока (коэффициент корреляции Спирмена составил 0,90). Наибольший прирост плотности монослоя наблюдали в контрольной группе: на 159,0 (148,0; 193,0) кл/мм²); наименьший – при концентрации ЦсА 2,0 мкг/мл: на 51,5 (42,0; 68,0) кл/мм² (Рисунок 15).

     В концентрациях 0,05 и 0,2 мкг/мл плотность клеток статистически значимо не отличалась от плотности клеток контрольной группы. Монослой характеризовали как плотный с близким прилеганием клеток друг к другу практически без свободных пространств (Рисунок 16). В концентрациях 0,5-2,0 мкг/мл наблюдали достоверное снижение плотности клеток в сравнении с контрольной группой в данные сроки (Таблица 12). В концентрации 1,0 мкг/мл плотность монослоя была наименьшей. Клетки находились на большом расстоянии друг от друга, их отростки были укорочены, определяли много свободных пространств. (Рисунок 16).

    С 4 по 7 сутки после добавления в питательную среду ЦсА культуры переходили в стационарную фазу, в которую скорость увеличения плотности монослоя значительно замедлялась. В рамках эксперимента не наблюдали фазу торможения и гибели клеток, что было доказано при определении ядерно-цитоплазменного соотношения и количества поврежденных клеток с помощью витальных красителей (описано далее в разделе 4.2.2). На 7 сутки при малых концентрациях ЦсА (0,05-0,2 мкг/мл) наблюдали плотный монослой с близко расположенными клетками, соединяющимися между собой отростками. При более высоких концентрациях (0,5-2,0 мкг/мл) в монослое обнаруживали пространства, свободные от клеток. При этом отмечали некоторое укорочение отростков с сохранением адгезивной способности (Рисунок 17).

     Для объективной оценки пролиферативной активности фибробластов определяли следующие показатели пролиферации: индекс пролиферации (PI), время удвоения культуры (DT) и количество удвоений культуры (PDL). Индекс пролиферации и время удвоения культуры определяли на 3 сутки эксперимента, когда исследуемые культуры находились в фазе логарифмического роста, и скорость деления клеток была наибольшей. Количество удвоений определяли за все время эксперимента. При анализе данных показателей наблюдали постепенное снижение индекса пролиферации в обратной зависимости от концентрации ЦсА в питательной среде. Корреляция между данными значениями характеризовалась как сильная, и коэффициент корреляции Спирмена составил -0,92. Также наблюдали дозозависимое увеличение времени пролиферации культур с добавлением ЦсА с коэффициентом корреляции 0,93. Время удвоения культур с иммунодепрессантом превышало данный показатель контрольной группы в 1,5-5,1 раз в прямой зависимости от концентрации ЦсА. Количество удвоений культуры за все время эксперимента также находилось в обратной зависимости от концентрации препарата с высоким коэффициентом корреляции: -0,78. При этом в концентрации ЦсА 1,00 мкг/мл удвоения культуры не зафиксировали. Значения вышеуказанных показателей достоверно отличались от значений контрольной группы во всех концентрациях (Таблица 13).

    Полученные данные свидетельствует о дозозависимом подавлении пролиферации фибробластов теноновой капсулы человека циклоспорином А в пределах концентраций 0,05-2,0 мкг/мл.

    4.2.2. Определение цитотоксичности циклоспорина А

     Для определения возможной цитотоксичности ЦсА в пределах исследуемых концентраций и выявления клеток с поврежденными мембранами на 7 сутки эксперимента культуры клеток окрашивали трипановым синим, а также набором флуорофоров «Live/Dead Cell-Mediated Cytotoxicity Kit». Окраска суданом IV и гематоксилином позволяла более детально оценить морфологию клеток и выявить липидные включения в цитоплазме, свидетельствующие об изменении клеточного обмена.

    Медиана и квартили Q₁ и Q₃ ядерно-цитоплазменных соотношений группы контроля составили 0,11 (0,07; 0,13) отн. ед., в то время как значения медиан в образцах, культивируемых с добавлением ЦсА, составили от 0,10 до 0,13 отн. ед. вне зависимости от концентрации препарата (Таблица 14).

     Различия данного показателя между исследуемыми группами и контрольной группой не были достоверными. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на 7-е сутки эксперимента все культуры клеток находились в стационарном состоянии, а сниженную плотность клеток в культурах с добавлением ЦсА наблюдали не за счет гибели клеток, а за счет торможения их пролиферации.

    При обработке монослоя трипановым синим обнаруживали единичные клетки со слабоокрашенной цитоплазмой и ядром в образцах, культивируемых в питательной среде с содержанием ЦсА 0,05, 0,2 и 0,5 мкг/мл. При этом отмечали тенденцию к уменьшению количества окрашенных клеток с увеличением концентрации ЦсА, что может быть связано с большей подверженностью активно пролиферирующих клеток воздействию препарата в сравнении со стационарными клетками вне митоза (Рисунок 18). Не обнаруживали поврежденных клеток в образцах, культивируемых при концентрациях ЦсА 1,0 и 2,0 мкг/мл, что, вероятно, связано с практически полной остановкой пролиферации в данных культурах.

     При анализе препаратов, окрашенных суданом IV и гематоксилином, не обнаруживали повреждения клеточных мембран. Границы клеток были четкими, цитоплазма гомогенной. Ядра были базофильными, содержали 2-4 ядрышка, расположенных эксцентрично. В концентрациях ЦсА 0,05 мкг/мл и 0,2 мкг/мл обнаруживали клетки в фазе деления. При концентрации 1,0 и 2,0 мкг/мл обращали на себя внимание большие расстояния между клетками (Рисунок 19).

    Анализ препаратов, окрашенных набором флуорофоров, позволил количественно оценить степень токсичности исследуемых концентраций препаратов. При визуальной оценке абсолютное большинство клеток во всех исследуемых концентрациях имели зеленое свечение, свидетельствующее об их жизнеспособности. Среди них обнаруживали единичные клетки с красными ядрами, что свидетельствовало о повреждении или повышении проницаемости мембран данных клеток (Рисунок 20).

    В большинстве исследуемых образцов процент поврежденных клеток был меньше, чем в контрольной группе, и составлял от 0,0% до 6,4%. Доля поврежденных клеток в контрольной группе варьировала в пределах 1,4-6,4%. Статистически достоверной разницы в цитотоксичности не было обнаружено ни в одной из концентраций в сравнении с группой контроля (Таблица 15).