Анализ полиморфизма генов матричных металлопротеиназ ММР2, ММР3 и ММР9 среди российских европеоидных пациентов с первичной открытоугольной глаукомой

    

    Актуальность

    Глаукома – ведущая причина глобальной необратимой слепоты, являющаяся второй по значимости после катаракты, остается серьезной медицинской и социальной проблемой на фоне стареющего населения во всем мире [1]. Если к настоящему моменту разработаны достаточно радикальные методы лечения возрастной катаракты на базе протезирования искусственного хрусталика, то лечение глаукомы представляется по-прежнему сложной задачей. Повышенное внутриглазное давление (ВГД), которое обусловлено высокой устойчивостью к оттоку водянистой влаги через трабекулярную сеть (ТС) по обычному пути оттока, признано ведущим фактором риска развития глаукомы. Сопротивление оттоку, генерируемое в ТС, сопровождается ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM – extracellular matrix) членами семейства матриксных металлопротеиназ (MMР – matrix metalloproteinase). ММР-1, -2, -3, -9, -12 и -14, а также их эндогенный ингибитор TIMP-2 (tissue inhibitor of matrix metalloprotease) постоянно секретируются клетками ТС. Вместе они расщепляют широкий спектр субстратов трабекулярного ECM, тем самым нарушая его сложную супермолекулярную организацию и обеспечивая эндоцитоз и внутриклеточную деградацию продуктов расщепления клетками юкстаканаликулярного слоя [2, 3]. Значение ММР показано при ремоделировании структур глаза, наиболее значимых для развития глаукомы, при повреждении трабекулы, индукции апоптоза и развитии нейродегенеративных процессов в зрительном анализаторе, ремоделировании решетчатой пластины склеры и области диска зрительного нерва [3–5]. Доказательства этому приведены также в исследованиях с использованием проточной органотипической культуры переднего сегмента кадаверного глаза. Добавление рекомбинантных ММР-2, ММР-3 или ММР-9 приводило к обратимому увеличению оттока водянистой влаги, тогда как ингибирование эндогенной активности ММР способствовало его снижению [6]. Изменение уровней ММР при глаукоме выявляют во внутриглазной жидкости, в сыворотке и плазме крови, слезной жидкости [7–10]. MMP-2 совместно с MMP-9 участвуют в деградации коллагена IV типа, главного компонента базальных мембран, фиброзно-соединительной оболочки глаза и роговицы, деградации денатурированных коллагенов [11]. Есть мнение, что MMР-9 также участвует в регуляции гибели клеток сетчатки, устраняя опосредуемые интегрином сигнальные пути посредством деградации ламинина [12]. ММР-3 катализирует деградацию многих компонентов соединительной ткани, включая коллаген II, IV, IX и XI типов, протеогликаны, ламинин и фибронектин; может индуцировать синтез некоторых про-ММР – в частности про-ММР-1 и про-ММР-9 [13].

    Анализ генетических факторов развития глаукомы является важным звеном понимания механизмов развития болезни, о чем свидетельствует более высокий риск как открытоугольной, так и закрытоугольной глаукомы среди родственников первой степени пораженных лиц в исследованиях близнецов и семей [14]. Показано, что полиморфизм регуляторных регионов кодирующих ММР генов может влиять на уровень их экспрессии и способствовать предрасположенности к развитию болезни [15].

    Цель

    Изучить особенности полиморфизма генов матричных металлопротеиназММР2, ММР3 и ММР9 у пациентов с диагнозом «II (развитой) стадия первичной открытоугольной глаукомы».

    Материал и методы

    Пациенты. В исследование включены 99 пациентов с верифицированным диагнозом «II (развитая) стадия первичной открытоугольной глаукомы» (по МКБ-10, текущей версии 2016 г. пересмотра – H40.1). Количество мужчин составило 52 (52,53%), женщин – 47 (47,47%), средний возраст пациентов равнялся 62,8±4,3 года. Всем пациентам проведено офтальмологическое обследование – определение остроты зрения, бинокулярная офтальмоскопия, сферопериметрия, эхоофтальмография, оптическая когерентная томография, измерение ВГД.

    Пациенты исследуемой группы имели компенсированное (менее 22 мм рт.ст. на фоне применения медикаментозной терапии) или умеренно повышенное (менее 33 мм рт.ст.) ВГД. Группу сравнения составили 100 человек: 81 женщина и 19 мужчин. Средний возраст – 63,5±0,4 года. Критерием включения в группу сравнения явилось отсутствие у обследуемых пациентов диагноза «глаукома». Обе группы пациентов достоверно не различались по возрастным характеристикам. Пациенты обеих групп являлись представителями европеоидного русскоязычного населения России, родившимися на ее территории, идентифицирующими себя и свои предков как «русские».

    Критериями исключения для обеих групп являлись: острые заболевания и обострения хронических воспалительных заболеваний органа зрения, наличие диабетической ретинопатии, неоваскулярной глаукомы, увеита различной этиологии и локализации, гемофтальма, аутоиммунных и опухолевых процессов любой локализации, сахарного диабета без офтальмологических проявлений. Исследование было одобрено комитетами по биомедицинской этике Новосибирского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России и НИИКЭЛ – филиал ФГБНУ «ФИЦ ИЦИГ СО РАН». У всех пациентов было получено информированное согласие на забор крови, а также использование данных исследования в научных целях.

    Генотипирование. Генотипирование полиморфизмов промоторного региона генов ММР3 (rs3025058) и ММР9 (rs3918242) осуществляли методом ПДРФ (рестриктный анализ продуктов амплификации) [17]. ММР2(rs2438650) полиморфизм анализировали методом TaqMan зондов (Синтол, Россия) с помощью RealTime ПЦР с использованием коммерческих тест-систем на амплификаторе «ДТ-96» (ДНК-Технология) согласно инструкции фирмы-производителя.

    Статистическая обработка. При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генотипов, отношение шансов (OШ) с расчетом 95% доверительного интервала (95% ДИ). Расчет величины OШ проводили по методу Вульфа – Холдейна. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Использовался пакет прикладных программ SPSS 23.

    Результаты

    Нами был проанализирован однонуклеотидный полиморфизм (SNP) промоторных регионов генов ММР2-1306C→T, ММР3-11715A→6A, ММР9-1562C→T в группе пациентов с диагнозом «II (развитая) стадия первичной открытоугольной глаукомы» относительно контрольной группы. Анализ частот распределения генотипов в группах выявил, что среди пациентов с глаукомой достоверно реже выявляется минорный гомозиготный генотип MMР2-1306 TT (ОШ=0,24, р=0,0140) и увеличена частота гетерозиготного генотипа MMР2-1306 СT (OШ=2,01, р=0,0204) (табл. 1). Выявлено два комплексных генотипа, ассоциированных с заболеванием. Комплексными генотипами считались комбинации генотипов разных генов либо комбинации генотипов в нескольких полиморфных позициях одного гена. При анализе данных комплексных генотипов исследуемых генов показано, что гетерозиготный генотип MMР2-1306 СT входит в состав обоих комплексов, частота которых достоверно выше у пациентов, страдающих глаукомой. Причем в выявленных нами комплексах отношение шансов развития заболевания выше, чем при анализе единичной полиморфной позиции MMР2-1306 СT (табл. 2). Так, частота комплексного генотипа MMP2-1306 TC:MMP3-1171 6A6A более чем в 3 раза выше среди пациентов с глаукомой, а частота комплексного генотипа MMP2-1306 TC:MMP9-1562 ССболее чем в 2 раза выше среди пациентов с этим заболеванием.

    Предполагая, что гендерный фактор может отражаться на развитии болезни, мы проанализировали генетические особенности исследуемых MMP в группах мужчин и женщин. Нами не выявлено достоверных различий как между мужской и женской группами с глаукомой, так и между мужчинами с глаукомой и контрольной мужской группой. Однако в группе женщин с глаукомой относительно женщин без глаукомы подтвержден протективный генотип MMP2-1306 TT, причем значение отношения шансов только в женской группе выше, чем в общей группе пациентов (OШ=0,11, р=0,0171). Аналогично, в женской группе показано более высокое значение отношения шансов развития болезни относительно общей группы и в комплексном генотипе MMP2-1306 TC:MMP3-1171 6A6A(OR=4,56, p=0,0149) (табл. 3).

    Обсуждение

    MMP составляют большое семейство секретируемых мембранно-связанных цинкозависимых протеолитических эндопептидаз, играющих роль в регуляции морфогенеза тканей, подвижности и росте клеток, реакции на повреждение и ремоделирование ECM не только путем деградации белков, связанных с матрицей, но также посредством хорошо контролируемого протеолиза специфических внеклеточных мишеней, включая рецепторы, цитокины, факторы роста и молекулы адгезии. Функциональную дисрегуляцию ММР ассоциируют с риском развития многих заболеваний человека, в том числе офтальмологических [11]. Желатиназы (ММР-2 и ММР-9) и стромелизин (ММР-3) присутствуют в склере и предположительно участвуют в ее ремоделировании [18].

    На сегодняшний день нет единого понимания роли полиморфизма кодирующих ММР генов, включая полиморфизм регуляторных регионов, связанных непосредственно с уровнем транскрипции белкового продукта. В двух проведенных метаанализах не представлено четкой позиции относительно ассоциированности полиморфизма MMP с различными формами глаукомы ни в азиатских, ни европейских популяциях, несмотря на доказанное функциональное значение в развитии и прогрессировании заболевания их белковых продуктов [19, 20]. Однако для ряда SNP MMP2и MMP9 была показана ассоциированность с некоторыми формами глаукомы [18]. Польские авторы выявили, что полиморфизм ММР2-1306 может быть ассоциирован с изменением в нейроретинальном пояске на ранней стадии развития открытоугольной глаукомы [21]. При анализе частоты распределения генотипов в полиморфной позиции MMP9-1562 для СT генотипа и MMP9-1562T аллельного варианта гена показано увеличение риска развития глаукомы в сравнении со здоровыми субъектами. Статистически значимое различие наблюдалось в частотах генотипов между случаями первичной закрытоугольной глаукомы и контролем в индийской и китайской популяциях. Однако в случаях открытоугольной глаукомы это различие было только пограничным. Более высокая частота генотипаCTнаблюдалась у пациентов с закрытоугольной глаукомой [22–24] Показано, что полиморфизм гена MMP9,в частности, в цисрегуляторной области, являющейся сайтом связывания для факторов транскрипции, может влиять на уровень его экспрессии и, следовательно, может изменять общий генетический риск возникновения или прогрессирования глаукомы [21]. Влияние полиморфных изменений в промоторных областях подтвердило, что аллель -1562Cгена MMP9показал только 21,86% транскрипционной активности аллеля -1562T. Авторы предположили, что повышенные уровни экспрессии ММР можно рассматривать как фактор риска развития заболевания [23]. Инсерция/делеция одного аденозина (5А/6А) в положении -1171 ММР3 промоторного региона (rs35068180 или rs3025058) может влиять на уровни транскрипции, что может отражаться на способности деградировать соединительную ткань и приводить к прогрессированию болезни. Исследования активности in vitro показали, что аллель 5Аобладает в 2 раза большей активностью промотора, чем аллель 6А, поскольку предполагаемый транскрипционный репрессорный белок предпочтительно связывается с промотором, содержащим последовательность 6А, и снижает уровень экспрессии гена. Это доказано в экспериментах по транзиторной трансфекции, где было обнаружено, что промоторная конструкция стромелизина-1 с 6Ав полиморфном участке экспрессирует меньше репортерного гена хлорамфениколацетилтрансферазы, чем конструкция, содержащая 5А[25]. Однако в единичных исследованиях не показана ассоциированность данного полиморфного сайта с развитием и прогрессированием глаукомы [26], что демонстрируют и наши данные. Однако в комплексных генотипах с генотипом ММР2 ТСполиморфные генотипы ММР3и ММР9с более низкой транскрипционной активностью показывают статистически значимое положительное отношение шансов развития анализируемой нами открытоугольной формы глаукомы.

    Предполагают, что существуют половые различия в генетической восприимчивости к глаукоме. Показано, что более высокая частота генотипа ММР9 CT наблюдалась у мужчин с открытоугольной глаукомой по сравнению с женщинами. Авторы предполагают, что это может быть следствием влияния эстрогенов на уровни провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, который, как известно, индуцирует экспрессию MMP9 в первичных и иммортализованных клетках. Транскрипция генов ММР, в свою очередь, усиливается провоспалительным цитокином TNF-α. Кроме того, такая специфическая для мужчин ассоциация согласуется с гипотезой снижения у женщин врожденного иммунного ответа [23, 27, 28]. Однако в нашем исследовании не было показано разницы в распределении частот генотипов между мужской и женской группами для генаММР9. Эти данные свидетельствует в пользу необходимости дальнейшего анализа полиморфизма ММРс четким клиническим выделением групп обследуемых и форм заболевания.

    Таким образом, нами впервые в группе жителей России европеоидного происхождения получены данные о том, что наличие в геноме индивида гетерозиготного варианта ТС гена ММР2 в позиции -1306 достоверно ассоциировано с риском развития первичной открытоугольной глаукомы. Данные об увеличении различий между частотой выявления изолированного гетерозиготного варианта MMР2-1306 СT среди пациентов с глаукомой и частой его выявления в составе комбинированных генотипов с генами ММР3и ММР9 подтверждают сложившееся представления о полигенном характере генетической предрасположенности к развитию как глаукомы, так и других заболеваний человека. В пользу такого заключения свидетельствуют и представленные в настоящем сообщении данные об увеличении частоты распространения комплексного генотипа MMP2-1306 TC:MMP3-1171 6A6A среди пациентов женского пола. Полученные нами данные о протективном значении наличия в геноме человека гомозиготного варианта гена ММР2-1306 ТТ позволяют использовать их в дальнейших разработках персонализированной предиктивной медицины, позволяющих на ранних доклинических этапах прогнозировать наличие предрасположенности или наоборот устойчивости индивида к будущему развитию глаукомы и проводить профилактические мероприятия на донозологических этапах.

    Заключение

    ММР2-1306 ТС генотип достоверно ассоциирован с риском развития первичной открытоугольной глаукомы у жителей России европеоидного происхождения.

    ММР2-1306 ТТ генотип является протективным для развития глаукомы.

    Анализ комплексных генотипов подчеркивает полигенный характер развития глаукомы.

    

    Информация об авторах

    Алла Владимировна Шевченко, д.б.н., shalla64@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-5898-950X

    Виктор Федорович Прокофьев, к.м.н., vprok@ngs.ru, https://orcid.org/0000-0001-7290-1631

    Владимир Иосифович Коненков, д.м.н., профессор, академик РАН, vikonenkov@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-7385-6270

    Ольга Викторовна Ермакова, к.м.н., oven_e@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0427-1564

    Валерий Вячеславович Черных, д.м.н., профессор, sci@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-7623-3359

    Александр Николаевич Трунов, д.м.н., профессор, trunov1963@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-7592-8984,

    Information about the authors

    Alla V. Shevchenko, Doctor of Sciences in Biology, shalla64@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-5898-950X

    Viktor F. Prokof'ev, PhD in Medicine, vprok@ngs.ru, https://orcid.org/0000-0001-7290-1631

    Vladimir I. Konenkov, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, vikonenkov@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-7385-6270

    Ol'ga V. Ermakova, PhD in Medicine, oven_e@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0427-1564

    Valerii V. Chernykh, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, sci@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-7623-3359

    Aleksandr N. Trunov, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, trunov1963@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-7592-8984

    Вклад авторов в работу:

    А.В. Шевченко: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    В.Ф. Прокофьев:сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    В.И. Коненков: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    О.В. Ермакова: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    В.В. Черных: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    А.Н. Трунов: сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Authors' contribution:

    A.V. Shevchenko: collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    V.F. Prokof'ev: collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    V.I. Konenkov: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    O.V. Ermakova: collection, analysis and processing of material, writing.

    V.V. Chernykh: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    A.N. Trunov: collection, analysis and processing of material, writing, editing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 22.10.2022

    Переработана: 26.11.2022

    Принята к печати: 26.01.2023

    Originally received: 22.10.2022

    Final revision: 26.11.2022

    Accepted: 26.01.2023