Современные технологии микробиологических исследований в офтальмологии. часть 1

    

    Актуальность

    Основными задачами медицинской микробиологии в офтальмологии являются идентификация микроорганизмов, определение их клинической значимости и профиля устойчивости к антибиотикам (АБ) в максимально короткие сроки. При классическом культуральном исследовании результат получают на 3–7-е сутки после отбора материала. Клиническая значимость микробиологических исследований крайне важна, своевременное подтверждение бактериальной или грибковой этиологии процесса, определение in vitro чувствительности к АБ напрямую связано с эффективностью терапии, позволяет избежать функциональной и/ или анатомической потери глаза как органа, в кратчайшие сроки помогает модифицировать терапию у пациентов с недостаточным клиническим ответом на лечение. Точная и быстрая диагностика улучшает клинические прогнозы, укорачивает сроки госпитализации и уменьшает расходы. Офтальмологи нуждаются в прогрессивных технологиях микробиологии, позволяющих за 24–48 ч идентифицировать возбудителя со спектром антибиотикорезистентности.

    Цель

    Осветить современные микробиологические технологии идентификации микроорганизмов, такие как масс-спектрометрия, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, лазерное светорассеивание.

    Материал и методы

    Для выполнения обзора был осуществлен поиск научных публикаций отечественных и зарубежных авторов на ресурсах PubMed, Medline, eLIBRARY c 2008 до 2021 г., посвященных существующим на настоящий момент методам идентификации микроорганизмов с акцентом на офтальмологическую микробиологическую диагностику.

    Результаты

    Современные микробиологические технологии идентификации микроорганизмов

    На сегодняшний день в микробиологии оправданно внедрение новых диагностических технологий с высокой скоростью и производительностью, с достаточной чувствительностью и экономической доступностью оценивающих присутствие патогена, его жизнеспособность и степень вирулентности. Основные технологии идентификации реализуются на основе нескольких подходов: иммунохимические реакции, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, лазерное светорассеяние, масс-спектрометрия. У каждого способа есть свои преимущества и недостатки [1].

    На первом этапе исследования (индикация – выделение возбудителя) можно получить ответ об отсутствии или наличии бактериальной или микологической культуры в биоматериале.

    Микроскопия нативного материала эффективна при высокой концентрации микроорганизмов в биоматериале – более 104 КОЕ/мл. Далее традиционный алгоритм предполагает посев содержимого витреальной полости и/или передней камеры, отделяемого конъюнктивы, роговичного соскоба и др. на пластинчатые питательные среды и инкубацию 18–48 ч. Альтернативой является посев на жидкие питательные среды микробиологических анализаторов, позволяющие снизить вероятность контаминации пробы и сократить время инкубации до 4–18 ч (BacT/ALERT bioMeriex; BACTECТМ, Becton Dickinson, Phoenix Automated Microbiology System, Becton Dickinson; Signal, Oxoid; OmniLOG™, BIOLOG, MicroScan, Siemens Healthcare Diagnostics; VITEK, BioMerieux). Эти системы рассчитаны на объем жидкости от 1 мл, что важно в офтальмологии.

    В настоящее время на рынке появились анализаторы, позволяющие исследовать малые объемы стерильных жидкостей от 0,2 мл, например при эндофтальмите, с инкубацией в среднем 3–4 ч (приборы HB&L Uroquattro Light, Alfred 60, Alifax, Италия), которые уже широко используются в мире. Принцип работы анализаторов – явление лазерного светорассеяния: микроорганизмы в жидкой среде рассеивают проходящий свет лазера. Методика позволяет определять микроорганизмы при первоначальной концентрации от 10 КОЕ/мл. Видовой спектр культивируемых бактерий, включает так называемые «прихотливые» микроорганизмы (Haemophilus influenzaе, Neisseria meningitidis). Исследования показали высокую корреляцию результатов культурального роста на анализаторах с технологией Alifax с традиционными методами [2–5].

    Второй этап микробиологических исследований связан с получением чистой культуры – высев на пластинчатые питательные среды для получения изолированных колоний микроорганизмов.

    Для первичного посева наряду с традиционными средами, которые обеспечивают рост большого спектра микроорганизмов, при подозрении на определенные группы возбудителей можно использовать селективные, хромогенные среды, которые позволяют выделить и провести первичную идентификацию микроорганизмов через 16–18 ч и дать предварительный ответ клиническому врачу (Merck, CHROMagarТМ, DRG, Bio-Rad). Такие среды позволяют обнаружить даже единичные мелкие колонии в сложных полимикробных культурах [6, 7].

    Третий этап – видовая идентификация микроорганизмов изолированных колоний. Для идентификации изолятов используют биохимические тесты, в т.ч. с использованием селективных и хромогенных сред, иммунологические, молекулярно-биологические методы (протеомный анализ, ПЦР, секвенирование, масс-спектрометрия). В практических лабораториях преимущественно пользуются биохимическими тестам с использованием ручных методик или автоматизированных систем (MicroScan, Siemens HD; VITEK, ATB Expression BioMerieux; Phoenix Automated Microbiology System, Becton Dickinson; Signal, Oxoid; OmniLOG™, MicroStation, BIOLOG; SENSITITRE, TREK Diagnostic Systems). Применение микробиологических анализаторов позволяет значительно расширить спектр определяемых возбудителей, проводить одновременно оценку чувствительности к антибиотикам, сократить данный этап исследования с 18–20 до 6 ч. Подобные тест-системы значительно увеличивает себестоимость анализа, но это оправданно более надежной по сравнению с фенотипической идентификацией для всех бактериальных и грибковых изолятов глазных инфекций [8–10].

    Масс-спектрометрия

    В последние годы для идентификации микроорганизмов активно используется метод времяпролетной масс-спектрометрии с технологией матрицактивированной лазерной десорбции/ионизации (MALDITOF – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, TimeOf-Flight). Метод позволяет проводить детекцию бактерий и грибов по протеиновому профилю. Время исследования 96 образцов с пробоподготовкой – менее 30 мин [11, 12].

    Масс-спектрометрический анализ (МS-анализ) предполагает измерение и регистрацию отношения массы заряженных частиц веществ (ионов) к их заряду (m/z).

    В рутинной практике микробиологический образец смешивается с реагентом (матрицей), суспензия на специализированные пластинах помещается в масс-спектрометр, в котором бомбардируется короткими импульсами лазера, происходят десорбция и ионизация биомолекул и разделение по их индивидуальной характеристике – соотношению массы к заряду. В итоге на детекторе формируется уникальный спектр, который сравнивается с базой (библиотекой) данных спектров различных микроорганизмов. Референсные базы данных содержат информацию о 2500–2900 видах микроорганизмов и 5600–8300 их штаммов, данные постоянно обновляются. И в ряде случаев есть возможность более детальной токсономической идентификации до вида, в сравнении с биохимическими тестами определения лишь рода некоторых бактерий [10]. МS-анализ – уникальный, высокоэффективный, точный, экономичный метод идентификации микроорганизмов, перспективный, получивший широкое распространение в клинической микробиологии. Простота позволяет применять методику в рутинных исследованиях многопрофильных стационаров [12–16].

    Существует и ряд сложностей с идентификацией некоторых бактерий. Например, невозможно идентификации S. pneumoniaeв связи с высоким сходством белкового профиля различных видов α-гемолитических стрептококков [18]. Есть трудности с идентификацией бактерий из типа Actinobacteria, родов Kosuria, Nocardia, Shigella, Streptococcusи некоторые других [14, 17].

    Проведение МS-анализа возможно без предварительного культивирования, но с экстракцией из образца (кровь, моча, мокрота, ликвор, гной и т.д.) микробных протеинов по определенным методикам, если в исследуемом объеме образца содержится не менее 5·10⁵ бактерий, а для типа Actinobacteria – не менее 10⁶ клеток [1, 14, 20].

    Необходимость внедрения MALDI-TОF MS идентификации микроорганизмов в практику клинической микробиологии в том числе для офтальмологических больных определяется высокой диагностической эффективностью метода, экономической целесообразностью, быстротой получения результатов и простотой методологией исследований [10, 13, 21].

    Наиболее широко используемыми коммерчески доступными являются системы MALDI-TOF MS: Microflex LT/SH MALDI-TOF, MALDI Biotyper (Bruker) и VITEK MS (bioMerieux) [22, 23].

    Полимеразная цепная реакция

    Идентификация микроорганизмов ПЦР в различных модификациях используется в микробиологии более 25 лет. ПЦР, несмотря на быструю специфическую идентификацию возбудителя, до настоящего времени не получил широкого распространения из-за ряда недостатков. ПЦР имеет самый высокий процент положительного результата, особенно изначально нестерильного биоматериала, например при кератите, в случаях с отрицательными результатами посева или микроскопии мазка первичного биоматериала, так как амплифицируется материал не только живых патогенов, но и остаточных количеств нуклеиновых кислот погибших микроорганизмов. В то же время ПЦР эффективен и экономически оправдан для определения антибиотикорезистентности [24].

    Ряд исследователей на офтальмологическом материале показывают выделение большего количества возбудителей методом ПЦР в сравнении с фенотипической идентификацией, указывают на ценность ПЦР анализа у пациентов с начатой антибиотикотерапий, которая препятствует качественному культивированию микроорганизмов. Рекомендуют совмещать культуральные методы с ПЦР-диагностикой возбудителей. Такие данные будут ценными для ретроспективного анализа изучении факторов и условий распространения тех или иных возбудителей глазных инфекции в различных популяциях. Но к таким результатам нужно относится критически в клинической практике, так как полученное ДНК может быть дериватами погибших микроорганизмов, не имеющих практического значения в лечении пациента на этапе получения результата данной диагностики методом ПЦР [25–28]. По этой причине, в ряде стран метод ПЦР не был разрешен в целях диагностики для соскобов роговицы. Таким образом, ПЦР не рекомендуется как самостоятельный метод рутинной диагностики инфекционного кератита, необходимо предварительное выделение чистой культуры микроорганизмов другими методами.

    Тем не менее ПЦР-исследование полезно для обнаружения и последующей идентификации грибковой ДНК в соскобах роговицы или внутриглазных жидкостей, что позволяет начать противогрибковую терапию на ранней стадии заболевания [1, 29–31]. ПЦР незаменима для диагностики вирусов и простейших [25, 32, 33].

    На современном этапе для качественной идентификации широкого спектра микроорганизмов (бактерий, грибов, вирусов, простейших) методика ПЦР представлена в формате биочипов (биологических микрочипов). Биочип – матрица из тысяч микроячеек с нанесенными на них молекулярными зондами для одновременного анализа большого числа искомых биомолекул. Зондами могут служить олигонуклеотиды, участки геномной ДНК, РНК, олигосахариды, антитела, различные низкомолекулярные соединения и др.

    Недостаток технологии биочипов – длительная пробоподготовка (24–48 ч) и приборная амплификация нуклеиновых кислот в пробах, что снижает практическую значимость метода в неотложных клинических случаях в офтальмологии. Технологически метод постоянно совершенствуется, последние модификации, представленные в формате microarray-чипов, дают результаты в более короткие сроки (4–8 ч), но остаются дорогостоящими. При этом диагностические возможности методики достаточно широки. Например, одна из базовых платформ компании PathGEN Dx (Сингапур) выпускает генетический чип для клинических исследований PathGEN ® PathChip. Он совмещается с системой анализа GeneChip ® System (Affymetrix, США), которая позволяет идентифицировать около 20 тыс. бактерий [34]. Другой производитель, Livermore National Laboratory – LLNL (США), предлагает microarray-инстументы для определения 2195 видов вирусов и 24 видов бактерий [32]. Недавно компания LLNL заявила о тестировании нового поколения microarray-чипов для определения 5700 вирусов, нескольких тысяч бактерий, нескольких сотен грибов и 75 простейших. В России лидером разработки microarray-устройств является Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, где были успешно сконструированы чип-инструменты для идентификации микобактерий, хламидий, микоплазм, вирусов гриппа, гепатитов, цитомегаловируса, вирусов иммунодефицита человека [25, 33].

    Секвенирование

    Биочипы усовершенствовали еще один инструмент молекулярно-генетических исследований – секвенирование, сделав его доступным для идентификации микроорганизмов без их предварительного культивирования.

    Секвенирование подразумевает определение последовательности нуклеотидов нуклеиновых кислот с целью идентификации микроорганизмов.

    Полногеномное или высокопроизводительное секвенирование последнего поколения, NGS-технология (от англ. Next generation sequencing – секвенирование следующего/нового поколения) позволяет определять микроорганизмы в смешанной культуре менее чем за сутки по профилю рибосомальной РНК [35]. Весьма интересной для клинической микробиологии является чип-система подготовки биологического материала для полупроводникового секвенирования Access Array IFC (Fluidigm Corporation, США), прибор MiSeq (Illumina, США) и др. Данная система анализа позволяет обнаружить и идентифицировать в исследуемом материале все клинически значимые микроорганизмы, оценить их вирулентные и резистентные свойства. Принципиальным достоинством биочипов является одновременная идентификация множества видов в одном образце, в том числе непосредственно в биоматериале от пациента [1, 36].

    Технология секвенирования постоянно эволюционирует. В настоящий момент существуют методы секвенирования третьего поколения (NNGS). От предшествующей NGS-технология их отличают: более простая процедура пробоподготовки, не требуется предварительной амплификации анализируемых фрагментов нуклеиновых кислот методом ПЦР, более короткое время анализа, нет необходимости многочисленных повторных секвенирований для устранения ошибок прочтения генома. NNGS-технология реализована на платформе SMRT (Pacific Biosciences) на основе секвенирования через нанопоры [19].

    Заключение

    Сегодня технологии микробиологии шагнули далеко вперед. С учетом «молниеносной» скорости распространения патологического процесса переднего и заднего отрезков глазного яблока, современные микробиологические подходы должны быть направлены на сокращение диагностического этапа до 6–12 ч, только в таком случае можно говорить о высокой вероятности положительного исхода проводимой этиотропной терапии.

    На сегодняшний день данные подходы активно организовываются между современными микробиологическими центрами, гражданскими и военными офтальмологическими службами РФ для улучшения здоровья и качества жизни ее граждан, а также способствуют снижению нагрузки на современное здравоохранение. Результаты данных организационных мероприятий будут изложены в следующих работах авторов.

    

    Информация об авторах

    Олег Владимирович Шиловских, к.м.н., врач-офтальмохирург, 2310161@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4931-8266

    Вячеслав Олегович Пономарев, к.м.н., врач-офтальмохирург, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Виктор Николаевич Казайкин, д.м.н., врач-офтальмохирург, victorru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Алексей Николаевич Куликов, д.м.н., профессор, врач-офтальмохирург, alexey.kulikov@mail.ru

    Надежда Сергеевна Демченко, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

    Константин Андреевич Ткаченко, врач-офтальмолог, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

    Яков Борисович Бейкин, заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор, действительный член РАЕН, inbox@kdc-lab.ru

    Софья Марковна Розанова, к.м.н., доцент, rsm@kdc-lab.ru

    Марина Валерьевна Кырф, врач-бактериолог, flame.teddy@gmail.com

    Information about the authors

    Oleg V. Shilovskikh, PhD in Medicine, Ophthalmic Surgeon, 2310161@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4931-8266

    Vyacheslav O. Ponomarev, PhD in Medicine, Ophthalmic Surgeon, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Victor N. Kazaikin, Doctor of Medical Sciences, Ophthalmic Surgeon, victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Aleksey N. Kulikov, Doctor of Medical Sciences, Professor, Ophthalmic Surgeon, alexey.kulikov@mail.ru

    Nadezhda S. Demchenko, PhD in Medicine, Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

    Konstantin A. Tkachenko, Ophthalmologist, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

    Yakov B. Beikin, Honored Doctor of the Russian Federation, Doctor of Medical Sciences, Professor, full member of the Russian Academy of Natural Sciences, inbox@kdc-lab.ru

    Sofia M. Rozanova, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, rsm@kdc-lab.ru

    Marina V. Kyrf, bacteriologist, flame.teddy@gmail.com

    Вклад авторов в работу:

    О.В. Шиловских: редактирование окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.О. Пономарев: написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.Н. Казайкин: редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    А.Н. Куликов: редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Н.С. Демченко: написание текста, редактирование.

    К.А. Ткаченко: редактирование.

    С.М. Розанова: редактирование.

    М.В. Кырф: редактирование.

    Authors' contribution:

    O.V. Shilovskikh: editing, final approval of the version to be published.

    V.O. Ponomarev: writing, editing, final approval of the version to be published.

    V.N. Kazaikin: editing, final approval of the version to be published.

    A.N. Kulikov: editing, final approval of the version to be published.

    N.S. Demchenko: writing, editing.

    K.A. Tkachenko: editing.

    S.M. Rozanova: editing.

    M.V. Kyrf: editing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 29.11.2022

    Переработана: 22.01.2022

    Принята к печати: 14.02.2023

    Originally received: 29.11.2022

    Final revision: 22.01.2022

    Accepted: 14.02.2023