Исследование клеточного состава богатой тромбоцитами плазмы для оптимизации ее использования в хирургии макулярных разрывов. Часть 1

    

    Актуальность

    В настоящий момент использование богатой тромбоцитами плазмы крови (БоТП; англ. Platelet rich plasma, РRР) является одним из успешных направлений тканевой инженерии и клеточной терапии в медицине [1]. В офтальмологии БоТП активно применяется в хирургии заболеваний сетчатки и переднего отрезка глаза [2–8]. В современной литературе представлено множество публикаций по использованию в клинической офтальмологии аутоплазмы с повышенным содержанием тромбоцитов, но нет единого представления и понимания о свойствах получаемых препаратов аутоплазмы, зависящих от их клеточного состава. Также описано большое количество классификаций и видов аутоплазмы в зависимости от способа получения и механизма действия [9, 10]. D.M. Dohan Ehrenfest и соавт. в 2008 г. представили достаточно простую в понимании классификацию, согласно которой выделили 4 группы препаратов плазмы с повышенным содержанием тромбоцитов, отличающихся клеточным составом и степенью активации фибриногена [11]. Регенераторное действие БоТП зависит от количества и качества содержащихся в ней тромбоцитов [12].

    В тромбоцитах различают гиаломер и грануломер. Гиаломер – это зона под мембраной тромбоцита, содержащая сократительные миофиламенты (актин, миозин и тропомиозин). Грануломер – зона с органеллами, гранулами и гликогеновыми везикулами. Различают секреторные гранулы трех типов.

    Альфа-гранулы содержат митогенные и хемотаксические факторы роста. Бетагранулы содержат аденозин-трифосфат, аденозиндифосфат, гуанозинтрифосфат, гуанозиндифосфат, серотонин, кальций и неорганический фосфат. Гаммагранулы (лизосомы) содержат кислую фосфатазу, р-глюкуронидазу, катепсин, кислые гидролазы. В тромбоцитах содержится большое количество тромбоксансинтазы, которая превращает арахидоновую кислоту клеточных мембран в тромбоксаны [13].

    Согласно современным представлениям, по морфо-функциональной характеристике выделено 4 типа тромбоцитов [14, 15].

    Platelet-large cell ratio (P-LCR; большие тромбоциты), относятся к 3-му и 4-му типам отростчатых дегранулированных тромбоцитов. Большие тромбоциты не содержат гранул, поэтому являются функционально неполноценными и не способны к выраженной адгезии и агрегации, не способны выполнять коагулологическую, ангиотрофическую, эндотелиальноподдерживающую, транспортную, ростстимулирующую функции и не обладают провоспалительной активностью, так как утратили биологически активные молекулы. Их доля от общего числа тромбоцитов составляет от 13–43%.

    Функционально полноценными являются только дискоциты и большие округлые тромбоциты с гранулами, т.е. тромбоциты 1-го и 2-го типов [15].

    Таким образом механизм действия БоТП заключается в том, что тромбоциты участвуют в регенерации тканей за счет факторов роста и других активных молекул (хемокинов, арахидоновой кислоты, фибриногена и фибрина [16]. В основе этих эффектов лежит синергичное взаимодействие с местными клетками, обусловливающее специфические реакции пролиферации, клеточной миграции и синтез экстрацеллюлярного матрикса [17].

    Для офтальмологического использования чаще применяются системы Ycellbio Kit и Arthrex ACP (аutologous сonditioned plasma). Обе методики отличаются способом заготовки и, следовательно, клеточным составом получаемого субстрата, в котором офтальмологов в первую очередь интересует концентрация тромбоцитов и в меньшей степени лейкоцитов [18].

    Цель

    Исследовать клеточный состав БоТП для оптимизации ее использования в хирургии макулярного разрыва (МР).

    Материал и методы

    В настоящем исследовании представлены результаты анализа БоТП 20 пациентов (6 мужчин и 14 женщин), прооперированных в АО «Екатеринбургский центр МНТК «Микрохирургия глаза» в период с апреля по июль 2021 г. по поводу сквозного МР. Возраст пациентов составил от 57 до 82 лет (69,0±1,2 года), все – без приема антикоагулянтов и антиагрегантов, без тромбоцитопатии и тромбоцитопении.

    Для получения БоТП использовался контейнер (пробирка) из силиконизированной пластмассы Ycellbio-Kit (Ycellbio Medical Co., Ltd, Южная Корея) и центрифуга СМ-6М (ELMI, Латвия). Условия центрифугирования: 3200–3400/мин в течение 4 мин, двукратное при завышенном гематокрите.

    Забор крови у пациента в шприц производился иглой 21G или иглой «бабочкой», не форсированно – для избежания повреждения клеток крови. Перед забором крови внутренняя поверхность цилиндра шприца обрабатывалась антикоагулянтом цитрат натрия, который обеспечивал жидкую консистенцию плазмы до момента ее аппликации в зону разрыва и не ограничивал хирурга по времени для выполнения этой манипуляции. Кроме того, цитрат натрия обеспечивал сохранность свойств тромбоцитов.

    Для анализа состава полученных в результате центрифугирования фракций крови использовался аппарат Sysmex XS-500i – гематологический 5-DIFF-анализатор, который позволял определять концентрацию тромбоцитов и эритроцитов, качественный состав тромбоцитов, дифференцировать лейкоциты на 5 популяций. Объем образцов крови составлял 20 мкл. Анализ плазмы проводился автоматически в зависимости от уровня исследуемой фракции, на котором устанавливался пробоотборник анализатора.

    При центрифугировании получались 2 основные (видимые) фракции крови: плазма и эритроцитарный слой (эритромасса). Плазма состояла из следующих слоев: в самой верхней части пробирки располагалась бедная тромбоцитами плазма (PPP, Platelet Poor Plasma), в верхнем сегменте узкой части пробирки – чистая БоТП (P-PRP, Pure Platelet Rich Plasma), в нижнем сегменте узкой части пробирки – также слой БоТП, но с бoльшим содержанием лейкоцитов, который поэтому называется лейкотромбоцитарным слоем (Leucocyte Platelet Rich Plasma, L-PRP). Под L-PRP, т.е. в нижней части пробирки, располагался эритроцитарный слой (рис. 1, 2).

    Исследование содержимого пробирки проводилось на 4 уровнях, представленных на рисунке 3. Основное внимание было уделено количественному составу тромбоцитов и лейкоцитов. Кроме того, с целью определения возможной корреляционной зависимости состава крови и состава БоТП было проведено исследование общего анализа крови (ОАК).

    Статистический анализ результатов исследования проводился при помощи пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2019 для операционной системы Windows.

    Результаты

    В результате проведенного исследования были получены следующие показатели тромбоцитов и лейкоцитов в ОАК и БоТП.

    Концентрация тромбоцитов в ОАК составила от 140 до 285•10³/мкл (215,85±9,23), P-PRP – от 699 до 5681•10³/мкл (2600,4±329,9), L-PRP – от 1995 до 9989•10³/мкл (6555,8±506,7).

    Концентрация лейкоцитов в ОАК составила от 3,83 до 7,73•10³/мкл (5,58±0,29), P-PRP – от 0,02 до 7,08•10³/мкл (1,49±0,58), L-PRP – 6,12-94,69•10³/мкл (99,3±38,1).

    Полученные результаты представлены втаблице 1.

    Показатели тромбоцитов и лейкоцитов в ОАК и БоТП представлены в таблице 2.

    Концентрация тромбоцитов меньше 1 млн/мкл в P-PRP была выявлена только в 2 случаях (10%), при этом у обоих пациентов отмечалась весьма низкая концентрация лейкоцитов: 699•10³/мкл (лейкоциты – 0,09•10³/мкл) и 707•10³/мкл (лейкоциты – 0,06•10³/мкл).

    Концентрация тромбоцитов в БоТП по сравнению с исходным уровнем в ОАК увеличилась в P-PRP в 2,6– 27,0 раза (11,6±1,5), в L-PRP – в 7,6–47,5 раза (29,2±2,3).

    Концентрация лейкоцитов по сравнению с исходным уровнем в ОАК в P-PRP уменьшилась в 0,9–671,9 раза (200,3±60,2), в L-PRP увеличилась в 1,6–93,3 раза (28,1±9,8).

    Показатели концентрации тромбоцитов и лейкоцитов во всех фракциях плазмы, эритроцитарном слое исследованной группы представлены на рисунке 3.

    В результате проведенного исследования были получены следующие показатели больших (дегранулированных) тромбоцитов (P-LCR) в ОАК и БоТП: в ОАК – от 17,9 до 65,7•10³/мкл (43,1±3,36), в P-PRP – от 17,10 до 1795,78•10³/мкл (675,65±117,78), в L-PRP – от 695,54 до 3425,04•10³/мкл (1830,52±202,27).

    Показатели P-LCR в ОАК и БоТП в группе представлены в таблице 3.

    Обсуждение

    Методика хирургии МР с применением БоТП, наряду с технологией перевернутого лоскута внутренней пограничной мембраны (ВМП), позволила поднять анатомический успех лечения этого заболевания на качественно новый уровень и облегчила выполнение самой операции. В настоящее время трудности продолжают вызывать пациенты с МР более 400 мкм и глаза с передне-задней осью более 26 мм [19, 20].

    Обогащенная плазма в своем составе, как следует из ее названия, содержит тромбоциты и растворенные в плазме белки (фибриноген и др.). Тромбоциты – плоские безъядерные клетки, образующиеся в костном мозге, содержат в своем составе: α-, β- и γ-гранулы, в которых депонируются более 30 факторов роста (ФР), цитокины, хемокины, адгезивные белки, Са²⁺ и другие активные вещества, миофиламенты, которые построены из сократительных белков (актина, миозина и тропомиозина) и обеспечивают около 80% сократительной активности будущего сгустка. Активация всех этих веществ происходит в результате дегрануляции тромбоцитов при механическом контакте последних с любыми клетками, отличными от эндотелия сосудов, особенно это выраженно при взаимодействии с коллагеновыми волокнами, обнажающимися в результате травмы (микротравмы) [21, 22]. Вариантом микротравмы может служить удаление ВПМ во время макулярной хирургии – процедуры, существенно ослабляющей центробежное тракционное воздействие на края разрыва, но неизбежно приводящей к микроповреждениям нейроэпителия сетчатки.

    Одновременно с вышеперечисленными процессами через молекулы белка-посредника (фактор фон Виллебранда) происходит адгезия тромбоцитов к краям разрыва и окружающей ее сетчатке и запускается процесс свертывания – образование сгустка. Растворенный в плазме белок фибриноген под действием тромбина и Са2+ последовательно переходит в фибрин-мономер, затем при участии фибриназы приобретает ковалентные связи и превращается в фибрин-полимер. Адгезия всего образующегося сгустка к поврежденной ткани осуществляется благодаря тромбоцитам и молекулам адгезии плазмы (фибронектин, тромбоспондин) [23, 24].

    Во время хирургического процесса эти внутри- и межклеточные взаимодействия выглядят следующим образом.

    После аппликации плазмы в зоне МР тромбоциты активируется, прикрепляются к поверхности сетчатки, высвобождают ФР, происходит формирование фибриновой матрицы. Факторы роста способствуют регенерации ткани. Сокращение миофиламентов тромбоцитов и фибрин-полимера способствует центростремительному стягиванию краев разрыва. Фибриновая матрица при смыкании разрыва, кроме того, обеспечивает поддержку высокой концентрации ФР в зоне разрыва и способствует пролиферации клеток. Далее наступает фаза регресса сгустка, которая длится 3 суток при активном участии белка-фермента плазмина [8].

    Ключевым фактором эффективности БоТП является концентрация тромбоцитов, которая запускает регенеративные способности организма, количество введенной плазмы менее значимо. При увеличении концентрации тромбоцитов увеличивается концентрация факторов роста и миофиламентов. Наибольший стимулирующий эффект БоТП проявляется при концентрации тромбоцитов 1 000 000/мкл. При меньшей концентрации стимулирующий эффект снижается или отсутствует, при большей – не изменяется [12]. Хотя, по данным некоторых клинических исследований, БоТП эффективна и при концентрации тромбоцитов 300 000–700 000/мкл [7].

    На эффективность БоТП может влиять не только количественный, но и качественный состав тромбоцитов и способность их к запуску регенераторных процессов. Поэтому в настоящей работе было проанализирована доля больших тромбоцитов (P-LCR) в исследуемых фракциях крови, которые относятся к 3-му и 4-му типам отростчатых, дегранулированных тромбоцитов. Обладая двигательной активностью и многочисленными отростками цитоплазмотической мембраны, большие тромбоциты способны формировать тромбоцитарные агрегаты и участвовать в формировании тромбоцитарного каркаса для фибринового сгустка в месте смыкания и восстановления целостности поврежденной ткани. Но они уже не содержат гранул, поэтому являются функционально неполноценными и не способны к выраженной адгезии и агрегации, не способны выполнять коагулогическую, ангиотрофическую, эндотелиальноподдерживающую, транспортную, ростстимулируюшую функции и не обладают провоспалительной активностью, так как утратили биологически активные молекулы.

    Спорным эффектом для заживления МР является концентрация в БоТП лейкоцитов. По данным литературных источников, лейкоциты могут как усилить механизм восстановления тканей, снизить вероятность инфекции, так и усилить воспаление и способствовать образованию рубцов и фиброзу, что в значительной степени обусловлено нейтрофилами, влияющими на высвобождение свободных радикалов кислорода, катаболических цитокинов, матриксных металлопротеиназ (ММП) и интерлейкина В, разрушающих ткани [25–27].

    Для объективности этих оценок нужно сказать, что эти данные в основном исходят не из офтальмологии, а общесоматических разделов медицины – травматологии, стоматологии, урологии и др., в которых концентрация лейкоцитов, безусловно, играет большое значение в процессах ранозаживления [28].

    В офтальмологии предложено несколько методик получения БоТП, наиболее известными являются: система Ycellbio-Kit (Южная Корея), система Arthrex ACP (Германия), стерильная пробирка АРМ (Россия). Во всех случаях кровь пациента забирается в определенную емкость (вакуумная пробирка, двойной шприц, шприц-пробирка, сепаратор) и центрифугируется в заданных режимах. В результате происходит отделение аутологичной плазмы. Основное их отличие – различный качественный и количественный состав конечного продукта (содержание клеток в плазме). Качественный состав БоТП при центрифугировании крови в одних и тех же моделях пробирок у разных пациентов неоднороден. Хирургам в первую очередь интересен состав P-PRP – чистой обогащенной тромбоцитами плазмы и L-PRP (лейкотромбоцитарного слоя) – обогащенной тромбоцитами плазмы с большим содержанием лейкоцитов. Вопрос – какова реальная концентрация тромбоцитов и лейкоцитов в этих слоях, какой из них возможен для применения в хирургии МР и какой из них является наиболее оптимальным?
    Ответ на этот вопрос явился целью настоящего исследования. В результате проведенного исследования были выявлены следующие данные. Во-первых, концентрация тромбоцитов в БоТП по сравнению с исходным уровнем в ОАК после центрифугирования увеличивается с большим разбросом – в P-PRP в 2,6–27,0 раза, в L-PRP – в 7,6– 47,5 раза. При этом концентрация лейкоцитов по сравнению с исходным уровнем в ОАК в P-PRP уменьшается в 0,9–671,0 раза, а в L-PRP увеличивается в 1,6–93,3 раза. То есть были получены абсолютно непредсказуемые показатели и не было выявлено никакой корреляционной зависимости между концентрацией тромбоцитов и лейкоцитов в ОАК и в БоТП (R<0,25). Важно, что концентрация тромбоцитов и в P-PRP, и в L-PRP после центрифугирования оказалась достаточной для эффективного применения в хирургии МР. В чистой плазме – P-PRP – только в 10% случаев (2 пациента) она не достигла 1 млн/ мкл и составила 699 и 707•10³/мкл. Но даже эти показатели, согласно данным литературы, являются достаточными для стягивающей края разрыва и регенеративной активности БоТП. Это расширяет возможности хирурга во время операции по поводу МР – при недостаточном объеме слоя L-PRP или его отсутствии достаточно набрать P-PRP около слоя эритромассы. Кроме того, объем фракции P-PRP значительно больше, чем L-PRP, поэтому его можно использовать и для хирургии разрывов сетчатки больших размеров и другой локализации. Низкая концентрация лейкоцитов в слое P-PRP (0,02–7,08·10³/мкл (1,49±0,58) против 2,11–494,69·10³/мкл (99,3±38,1) в L-PRP (p<0,01), возможно, делает его более оптимальным для применения в офтальмохирургии.

    Заключение

    При использовании пробирки Ycellbio-Kit концентрация тромбоцитов в P-PRP составила от 699 до 5681 (2600,4±329,9)•10³/мкл, в L-PRP (ЛТС) – от 1995 до 9989 (6555,8±506,7)•10³/мкл (p<0,001), что значительно превышает либо приближено к наиболее оптимальной концентрации для активации регенераторных процессов в зоне макулярного разрыва (1000•10³/мкл).

    Концентрация лейкоцитов при использовании пробирки Ycellbio-Kit в P-PRP составила от 0,02 до 7,08•10³/мкл (1,49±0,58), в L-PRP – от 6,12 до 494,69•10³/мкл (99,3±38,1) (p<0,01), что позволяет утверждать, что P-PRP является менее реактогенной для развития возможных воспалительных процессов.

    Концентрация тромбоцитов и лейкоцитов на разных уровнях БоТП не зависит от показателей ОАК (R<0,25).

    БоТП в обеих фракциях – в P-PRP и L-PRP – обладает достаточной концентрацией тромбоцитов для послеоперационного смыкания краев МР, что упрощает процесс забора БоТП из пробирки и расширяет возможности для ее применения хирургии сетчатки.

    Доля больших (дегранулированных) тромбоцитов в P-PRP имеет меньший показатель по сравнению с L-PRP (22 и 27% соответственно) (p<0,01), следовательно доля функционально активных тромбоцитов составила 78% в P-PRP и 73% в L-PRP, что позволяет предположить более высокую регенеративную активность P-PRP.

    

    Информация об авторах

    Андрей Юрьевич Клейменов, врач-офтальмохирург, kley_82@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-1848-1207

    Виктор Николаевич Казайкин, д.м.н., victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Надежда Сергеевна Демченко, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики и лабораторной генетики, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0580-6188

    Андрей Витальевич Шалагин, врач клинической лаборатории, andrey_shalagin_2021@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-2559-6261

    Алина Сергеевна Козлова, врач-стажер, alina.kozlova1804@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-2559-6261

    Information about the authors

    Andrei Yu. Kleimenov, Ophthalmologist, kley_82@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-1848-1207

    Victor N. Kazaykin, Doctor of Sciences in Medicine, victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Nadejda S. Demchenko, PhD in Medicine, Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics and Laboratory Genetics, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0580-6188

    Andrei V. Shalagin, Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics, andrey_shalagin_2021@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-2559-6261

    Alina S. Kozlova, Resident doctor, alina.kozlova1804@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-2559-6261

    Вклад авторов в работу:

    А.Ю. Клейменов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.Н. Казайкин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Н.С. Демченко: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, написание текста.

    А.В. Шалагин: вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование текста.

    А.С. Козлова: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    Authors' contribution:

    A.Yu. Kleimenov: significant contribution to the concept and design of the work, editing, writing, final approval of the version to be published.

    V.N. Kazaikin: significant contribution to the concept and design of the work, editing, writing, final approval of the version to be published.

    N.S. Demchenko: significant contribution to the concept and design of the work, editing, writing.

    A.V. Shalagin: contribution to the concept and design of the work, editing.

    A.S. Kozlova: collection, analysis and processing of material, writing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for thepublication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: There is no conflict of interest.

    Поступила: 01.02.2023

    Переработана: 09.03.2023

    Принята к печати: 15.05.2023

    Originally received: 01.02.2023

    Final revision: 09.03.2023

    Accepted: 15.05.2023