Современные технологии микробиологических исследований в офтальмологии. Часть 2

    

    Актуальность

    Данная работа является продолжением обзора о роли микробиологических методов диагностики воспалительных заболеваниях в офтальмологии. В первой части были описаны современные методы идентификации возбудителей инфекций. В данном обзоре мы обсуждаем методы определения чувствительности к антибиотикам. Определение in vitroчувствительности к антибиотикам напрямую связано с эффективностью и своевременностью терапии нередко молниеносно развивающихся инфекций глаз. Ранняя микробиологическая диагностика, определяющая этиотропность лечения, позволяет избежать функциональной и/ или анатомической потери глаза как органа.

    Для детекции чувствительности к антибиотикам используют фенотипические, генетические и аналитические методы [1].

    Фенотипические подходы достаточно просты, доступны для выполнения в рутинной практике. Обычно применяют диско-диффузионный метод, метод серийных разведений или метод градиентных концентраций.

    Диско-диффузионный метод основан на выявлении сниженного диаметра зоны задержки роста на агаре тестируемого штамма при определении чувствительности к определенному антибиотику. Существуют приборы – видеокамеры, позволяющие проводить считывание результатов и сравнивание с базой данных (Adagio, BioRad Laboratories, BioMic). Такой способ требует относительно длительного времени для получения результата (18–24 ч) [2–6].

    Метод серийных разведений (микроразведений) применяется в автоматизированных (Phoenix, Becton Dickinson; VITEK, BioMerieux; WalkAway, Siemens др.) и полуавтоматических (SENSITITRE, TREC Diagnostic Systems) системах, в которых происходит автоматическая фиксация роста микроорганизмов в лунках планшет, содержащих различные концентрации антибактериальных препаратов. Использование в некоторых анализаторах для фиксации роста микроорганизмов нескольких показателей (метаболическая активность по RedOx индикации), степени мутности (пролиферация клеток, результат роста микроорганизмов) и кинетических параметров позволяет сократить время получения результатов до 4–10 ч. Благодаря программному обеспечению система автоматически выявляет и отслеживает различные механизмы резистентности бактерий к АБ. Например, экспертная система прибора Phoenix M50 (Becton Dickinson, США) содержит более 2000 комментариев. Автоматизированные системы определения чувствительности к антибиотикам методом серийных разведений по праву считаются самыми надежными и быстрыми [7, 8].

    Цель

    Осветить современные микробиологические технологии (масс-спектрометрия, полимеразная цепная реакции (ПЦР), секвенирование, лазерное светорассеивание) и методы (фенотипические, генетические, аналитические методы) для детекции чувствительности к антибиотикам.

    Материал и методы

    Для выполнения обзора был осуществлен поиск научных публикаций отечественных и зарубежных авторов на ресурсах PubMed, Medline, eLIBRARY c 2008 до 2021 г., посвященных существующим на настоящий момент методам определения чувствительности к антибиотикам с акцентом на офтальмологическую микробиологическую диагностику.

    Результаты

    Генетические подходы подразумевают выявление генов ферментов гидролиза антибиотиков с помощью различных видов ПЦР и секвенирования, которые позволяют быстро и надежно определить наличие соответствующих генов, их типовую принадлежность. Недостаток генетических методов заключается в том, что наличие гена не гарантирует экспрессии признака. Различные методы секвенирования нерентабельны для рутинных исследований, но являются мощным инструментом для программ эпиднадзора. Полученную информацию о генетической основе устойчивости можно использовать в схемах мониторинга, для объяснения механизмов, приводящиех к приобретению устойчивости к антибиотикам [9].

    Аналитические методы (модифицированный тест Ходжа, CIM-тест, МБЛ, Е-тест, Carba NP тест, методика с применением MALDI-TOF масс-спектрометрии, спектрофотометрия, иммунохроматографические, латеральные тесты) позволяют выявить факт наличия фермента гидролиза антибиотика.

    Методы разведения и эпсилометрические тесты (E-тесты) дают количественные значения для минимальной ингибирующей концентрации противомикробного препарата, которая предотвращает видимый ночной рост культуры. E-Test относится к градиентным методам тестирования и особенно полезен для привередливых микроорганизмов [9].

    CIM-тест (Carbapenem Inactivation Method) – специфический метод определения инактивации карбапенемов. Тест основан на определении ферментативного гидролиза меропенема при инкубации стандартного диска с данным препаратом в водной суспензии тестируемого микроорганизма [10]. Тест обладает высокой чувствительностью и специфичностью, широко используется для рутинных исследований, но длительный в выполнении, около суток.

    Carba NP тест представляет собой колориметрический тест, используемый для обнаружения продукции карбапенемаз энтеробактериями, Pseudomonas aeruginosaи Acinetobacter spp. без возможности их дифференциации. Тест основан на визуальной регистрации изменения цвета индикатора рН среды в результате гидролиза имипенема в присутствии продуцента карбапенемаз. Carba NP тест высоко чувствительный и специфичный (>90%), дешев и технически прост, получения результата – менее 2 ч [11].

    Большинство автоматических бактериологических анализаторов определяют чувствительность к противомикробным препаратам на основе турбидиметрического метода, анализ занимает на разных системах 4–15 ч (MicroScan, Siemens Healthcare Diagnostics; BD Phoenix Automated Microbiology System; VITEK, BacT/ALERT bioMeriex; BACTEC FX, Becton Dickinson; Signal, Oxoid; OmniLOG, BIOLOG; Microscan Walkaway Plus, Beckman Coulter). Чувствительность к противомикробным препаратам определяется с помощью тестовых карт, содержащих стандартные разведения различных антибиотиков, соответствующие пороговым значениям чувствительности [12–14]. Но автоматизированные тест-системы не лишены недостатков, так как возможно получение ложноотрицательных результатов, в сравнении с диско-диффузионным методом диагностики чувствительности к антибиотикам [15].

    Анализаторы Alifax (HB&L, HB&L Light, Alfred 60, Alifax, Италия), на основе технологии лазерного светорассеивания позволяют определять чувствительность к антибиотикам за 3–5 ч [16–18]. Технология анализаторов Alifax позволяет получать результат быстрее, чем при использовании большинства автоматических бактериологических анализаторов, на которых анализ занимает 4–15 ч [9]. Единственным недостатком является высокая стоимость реагентов.

    Весьма перспективной технологией оценки чувствительности к антибиотикам является вышеописанная масс-спектрометрия. MALDI-TOF MS считается надежной, быстрой, точной, простой в использовании и экологически чистой методикой, но дорогостоящей методикой для определения чувствительности к антибиотикам [19–21].

    Подходы к изучению антибиотикорезистентности методом MALDI-TOF MS можно условно разделить на 2 группы. Первая группа методов определяет наличие резистентности к конкретным препаратам и раскрывает ее механизмы. Одним из подходов 1-й группы является определение жизнеспособности микроорганизмов в присутствии антибактериального препарата. Такой методический подход получил название SILAC-технология (от англ. Stable isotope labelling by amino acids in cell culture). Подобные исследования успешно выполнены на эпидемически значимых в отношении кератита культурах Staphylococcus aureus [21–23], Pseudomonas aeruginosa [24], Enterococcus faecium [25], Neisseria gonorrhoeae [26].

    Вторая группа методов MS-анализа позволяет осуществить прямую детекцию компонентов микроорганизмов, ответственных за потерю чувствительности к антибиотикам. Иными словами, технологию MALDI-TOF MS предполагается использовать в протеомном варианте анализа структур, отвечающих за транспорт антибиотика через клеточные мембраны грамотрицательных бактерий, таких как порины и эффлюксные системы [27]. В приборном варианте детекция антибиотико-резистентности микроорганизмов реализована фирмой Bruker, которая выпустила на рынок модуль определения β-лактамазной активности MBT STAR-BL. Но есть ряд ограничений такого рода исследований: существующие протоколы не подходят для некоторых видов микроорганизмов; методическая невоспроизводимость некоторых способов в рядовых лабораториях; отсутствие стандартизованных критериев оценки резистентности, аналогичных стандартам Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам EUCAST и Института клинических и лабораторных стандартов США (CLSI) [1, 28].

    В отличие от бактериальных глазных инфекций, при грибковых воспалениях тестирование на чувствительность к антибиотикам не так часто используется. Недавние сообщения свидетельствуют о том, что нитевидные грибы обладают уникальными профилями чувствительности к специфическим противогрибковым препаратам in vitro, а также клиническими характеристиками. Кроме того, способность образовывать биопленку делает грибы более устойчивыми к противогрибковым средствам, чем их планктонные аналоги без биопленки [29].

    Заключение

    Представленные в обзоре современные микробиологические технологии определения резистентности к антибиотикам позволяют в кратчайшие сроки не только решить клинические задачи терапии конкретных пациентов, но и осуществлять эпидемиологический мониторинг для объяснения механизмов, приводящих к приобретению устойчивости к антибиотикам в популяции на протеомном и геномном уровнях, тем самым решая важнейшую задачу современной медицины – предупреждение и ограничение распространения резистентности к противомикробным и антимикотическим препаратам, расшифровывая молекулярные механизмы этих процессов.

    В современных условиях каждая лаборатория может индивидуально подобрать спектр технологий и приборные панели доступные по цене и удовлетворяющие потребность в надежной, быстрой, точной, простой методологии определения чувствительности к антибиотикам. В офтальмологии инфекционных заболеваний, учитывая «молниеносную» скорость распространения патологического процесса в глазу, современные микробиологические подходы напрямую связаны с эффективностью терапии, позволяют избежать функциональной и/ или анатомической потери глаза как органа.

    

    Информация об авторах

    Олег Владимирович Шиловских, к.м.н., врач-офтальмохирург, 2310161@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4931-8266

    Вячеслав Олегович Пономарев, к.м.н., врач-офтальмохирург, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Виктор Николаевич Казайкин, д.м.н., врач-офтальмохирург, victorru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Алексей Николаевич Куликов, д.м.н., профессор, врач-офтальмохирург, alexey.kulikov@mail.ru

    Надежда Сергеевна Демченко, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

    Константин Андреевич Ткаченко, врач-офтальмолог, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

    Яков Борисович Бейкин, заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор, действительный член РАЕН, inbox@kdc-lab.ru

    Софья Марковна Розанова, к.м.н., доцент, rsm@kdc-lab.ru

    Марина Валерьевна Кырф, врач-бактериолог, flame.teddy@gmail.com

    Information about the authors

    Oleg V. Shilovskikh, PhD in Medicine, Ophthalmic Surgeon, 2310161@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4931-8266

    Vyacheslav O. Ponomarev, PhD in Medicine, Ophthalmic Surgeon, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Victor N. Kazaikin, Doctor of Medical Sciences, Ophthalmic Surgeon, victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Aleksey N. Kulikov, Doctor of Medical Sciences, Professor, Ophthalmic Surgeon, alexey.kulikov@mail.ru

    Nadezhda S. Demchenko, PhD in Medicine, Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

    Konstantin A. Tkachenko, Ophthalmologist, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

    Yakov B. Beikin, Honored Doctor of the Russian Federation, Doctor of Medical Sciences, Professor, full member of the Russian Academy of Natural Sciences, inbox@kdc-lab.ru

    Sofia M. Rozanova, PhD in Medicine, Associate Professor, rsm@kdc-lab.ru

    Marina V. Kyrf, Bacteriologist, flame.teddy@gmail.com

    Вклад авторов в работу:

    О.В. Шиловских: редактирование окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.О. Пономарев: написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.Н. Казайкин: редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    А.Н. Куликов: редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Н.С. Демченко: написание текста, редактирование.

    К.А. Ткаченко: редактирование.

    С.М. Розанова: редактирование.

    М.В. Кырф: редактирование.

    Authors' contribution:

    O.V. Shilovskikh: editing, final approval of the version to be published.

    V.O. Ponomarev: writing, editing, final approval of the version to be published.

    V.N. Kazaikin: editing, final approval of the version to be published.

    A.N. Kulikov: editing, final approval of the version to be published.

    N.S. Demchenko: writing, editing.

    K.A. Tkachenko: editing.

    S.M. Rozanova: editing.

    M.V. Kyrf: editing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 29.02.2023

    Переработана: 17.04.2023

    Принята к печати: 14.05.2023

    Originally received: 29.02.2023

    Final revision: 17.04.2023

    Accepted: 14.05.2023