Онлайн доклады

Онлайн доклады

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.735

Сравнительная харктеристика влияния фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки


1Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
2НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ
3НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук
4Институт биологии гена Российской академии наук

    В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки, приводящая к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей.
    Несмотря на различие этиологических факторов в основе развития целого ряда патологий сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая и посттромботическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и т.д., лежат процессы патологического ангиогенеза, которые развиваются в результате дисбаланса между про-ангиогенными (VEGF — сосудисто-эндотелиальный фактор роста, FGF – фактор роста фибробластов, ангиогенин, интерлейкин 8) и антиангиогенными (ангиостатин, эндостатин, PEDF — фактор пигментного эпителия, PF4 — фактор тромбоцитов 4) факторами.
    На сегодняшний день перспективы проведения коррекции аномального ангиогенеза связаны, в основном, с группой препаратов (Луцентис, Авастин), являющихся блокаторами ангиогенного стимулятора — сосудисто-эндотелиального фактора роста — VEGF, т.е. только одного из звеньев антогонистической системы.
    Для достижения же необходимого эффекта, в такой системе необходимо наличие динамического баланса. Одним из представителей наиболее активных ингибиторов ангиогенеза является фактор пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor – PEDF) [3, 4, 6].
    PEDF — белок с молекулярной массой 50 килоДальтон, относится к классу серпинов, ингибиторов сериновых протеаз [8, 9]. Синтезируется в клетках пигментного эпителия сетчатки [11], содержится в высоких концентрациях в интерфоторецепторном матриксе и стекловидном теле, в более низких — в роговице, хрусталике и внутриглазной жидкости [9, 10, 11].
    Безусловный интерес PEDF представляет еще и в связи с тем, что он обладает нейротрофическим действием. Он поддерживает нормальное развитие фоторецепторов и экспрессию в них зрительного пигмента после гибели пигментного эпителия сетчатки [5], оказывает нейропротективное действие на фоторецепторы сетчатки при световом [2] и глутаматном повреждении [7], обладает способностью поддерживать выживание ретинальных нейронов после вызванной перекисью водорода гибели клеток in vitro [1].
    Однако для того, чтобы оценить перспективы и возможность применения этого фактора в клинической офтальмологии, необходимо проведение дальнейших экспериментальных исследований, направленных на изучение влияния PEDF на состояние сетчатки. В настоящее время в качестве экспериментальных моделей ряда патологий широко используются различные типы клеточных и тканевых культур. Наиболее перспективными для проведения исследований являются органотипические культуры сетчатки, обладающие следующими преимуществами: сохранность цитоархитектоники; отсутствие нейро-гуморальных воздействий; возможность создать модель, максимально соответствующую поставленным задачам.
    Цель работы — изучение влияния рекомбинантного PEDF и Авастина на состояние органотипических культур сетчатки.

Материал и методы
    В работе было использовано 90 эксплантатов сетчатки семидневных крыс: 30 эксплантатов культивировали с PEDF (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестернблот анализа), 30 — культивировали с Авастином (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа), 30 эксплантатов входили в группу контроля (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа).
    Изолированные глаза крыс промывали в 70% этиловом спирте и в двух сменах стерильного фосфатного буфера (DPBS; «Sigma»). Сетчатку выделяли в охлажденном DPBS, содержащем 0,8% глюкозы (G1 — DPBS). Цельную сетчатку промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой (DMEM⁄F12 с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% сыворотки).
    Цельные эксплантаты культивировали в прикрепленном виде в чашке Петри диаметром 30 мм.
    Культивирование проводили в инкубаторе во влажной камере при температуре +37 °С и содержании углекислоты 5% в культуральной среде DMEM⁄F12 (1:1) с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Смену среды производили каждые 2-3 суток.
    PEDF добавляли в среду в концентрации 0,5 μg⁄ml, а Авастин – 50 μg⁄ml. Эффективность этой концентрации была определена предварительно в экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Контролем служили эксплантаты, культивируемые без PEDF и Авастина.
    Культивирование производили в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференном растворе антифриза до окрашивания антителами.
    Во время эксперимента состояние эксплантатов и поведение клеток контролировали ежедневно с помощью микроскопа с фазовым контрастом. Для оценки жизнеспособности клеток эксплантата использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки и пропидий йодистый, который окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток.
    По окончании эксперимента эксплантаты промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% раствором параформальдегида в физиологическом растворе с добавлением 0,01 молярного фосфатного буфера при рН=7,4 в течение 20 минут при 4 °С. После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки просушивали и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммитированных нейробластов — β-III-тубулину в разведении 1:100 (Chemicon, MAB 1637) и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток — кислому глиальному фибриллярному белку — GFAP в разведении 1:80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов при 4 °С. После промывки в фосфатном буфере, эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши, меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении), оба в разведении 1:100.
    Для анализа антиангиогенных свойств был проведен Вестерн-блот анализ. Для этого использовали эксплантаты, культивируемые с PEDF, Авастином и эксплантаты из группы контроля. Метод основывается на определении количества экспрессируемого фактора фон-Виллебранда, который синтезируется в эндотелиальных клетках, являясь внутриклеточным протеином, специфичным для данного типа клеток. Для проведения метода приготавливали клеточные лизаты опытных и контрольных образцов при помощи Reporter Lysis Buffer. После обработки лизирующим раствором чашки помещали в жидкий азот на несколько секунд, а потом в термостат при +37 °С на 10 мин. Полученный лизат центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) с раствором для прокрашивания:
    50 мМ Tris (PH=6,8) .............1 мл
    50% глицерин..........................5 мл
    15% SDS ........................................1,5 мл
    15 β-меркаптоэтанол.........1,5 мл
    0,01% ВРВ....................................1 мл
    Для переноса на мембрану использовали режим переноса 2 мА⁄см² (стабилизация по току) 2 часа и напряжение не более 20В. Затем мембрану окрашивали Ponceau Red 3-5 минут на шейкере, чтобы проконтролировать наличие белка на мембране. Затем отмывали мембрану в буфере TBST 3 раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (anti-von Willibrand Faktor; разведение 1:1000) в 15 мл TBST ночь при +4 °С. Затем мембрану отмывали 15 минут в TBST буфере 2 раза по 10 минут на шейкере. После этого мембрану инкубировали с вторичными антителами (antirabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена; разведение 1:10000) 1,5 мл на 15 мл TBST ночь при +4 °С. Мембрану промывали в 20 мл TBST (15 минут два раза по 10 минут на шейкере). Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare). Правильность нанесения порций белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране. Мембрану инкубировали с первичными антителами (actin c-2; разведение 1:1000) по методике, описанной выше. Затем со вторичными антителами (антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена; в разведении 1:10000) и проявляли по методике, описанной выше.

Результаты и обсуждение
    В течение первых 5-7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. При проведении исследования в фазовом контрасте на данном этапе эксплантаты сетчатки при культивировании с PEDF и Авастином и без них по внешнему виду и по количеству выселившихся на дно клеток не отличались.
    На 14-й день культивирования происходило дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. При исследовании в фазовом контрасте в эксплантатах, культивируемых с PEDF, начинали формироваться многочисленные длинные отростки, выходящие за пределы эксплантатов (рис. 1-2). В контроле и в культурах с Авастином наблюдались глиальные клетки, единичные клетки с морфологией нейронов (рис. 3, 4) и единичные отростки нейронов.
    На 17-е и, особенно, на 21-е сутки культивирования продолжалось выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с PEDF, происходило дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности, происходило формирование новой сети из выселившихся нейронов (рис. 5-6). В контроле и в культурах с Авастином происходило в основном выселение глиальных клеток, наблюдались единичные клетки с морфологией нейронов и единичные отростки нейронов (рис. 7-8).
    На 30-е сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с PEDF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых значительно больше, чем на 21 сутки. В этих эксплантатах было обнаружено большое количество GFAPиммунонегативных — βIII-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть (рис. 9-10). За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии βIII-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле происходило расселение GFAP-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие βIII-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов в небольшом количестве. При этом аксоноподобные βIII-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и очень редко выходили за его пределы, в отличие от опыта (рис. 11-12).
    По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 30-е сутки в эксплантатах, культивируемых без PEDF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели как внутри, так и на поверхности эксплантатов (рис. 13). В эксплантатах, культивируемых с PEDF, очаги клеточной гибели были значительно меньше (рис. 14). Очаги клеточной гибели в культурах, культивируемых с Авастином, были меньше по сравнению с контролем, но больше, чем в культурах с PEDF (рис. 15).
    При проведении Вестерн-блот анализа была установлена идентичная ширина полос тестового белка — актина во всех опытах, что говорит о правильности проведения исследования. Кроме этого, выявлено, что в контроле экспрессия фактора фон-Виллибранда в 2 раза выше, чем при действии PEDF и Авастина, о чем свидетельствует ширина вторых полос на полученных результатах, характеризующих количество исследуемого белка (рис. 16).

Заключение
    Установлено, что по сравнению с Авастином и контролем в органотипических культурах сетчатки крысы при культивировании с PEDF увеличивается жизнеспособность клеток сетчатки; развивается активная клеточная миграция и активный рост βIII-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, выходящих за пределы эксплантата. Можно предположить, что эти тонкие аксоноподобные отростки являются регенирирующими аксонами выживших после эксплантации ганглиозных клеток.
    Выявлено, что в культурах сетчатки, культивируемых с PEDF и Авастином, экспрессия фактора фон-Виллибранда значительно меньше, чем без них. Полученные данные подтверждают наличие у фактора пигментного эпителия выраженных антиангиогенных свойств, которые сопоставимы по степени выраженности с Авастином.
    Таким образом, фактор пигментного эпителия (PEDF) обладает выраженными нейропротективными и нейротрофическими свойствами, а также имеет мощную антиангиогенную активность.
    Поступила 06.11.08
    Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 08-04-00881-а, 07-04-12120-офи, 07-04-00835-а) и Госконтрактом № 02.512.11.2224 от 4 июля 2008 г.

Просмотров: 444