Методика получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия

¹ Учреждение РАН «Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН»,
² Учреждение РАН «Центральная клиническая больница РАН», г. Москва
  
  Клеточно-регенеративная терапия возрастной макулярной дегенерации рассматривается как возможное решение проблемы сохранности и жизнеспособности сетчатки. Одно из перспективных направлений клеточно-регенеративной терапии — трансплантация ретинального пигментного эпителия (РПЭ). В связи с чем, поиск технологий выделения и культивирования РПЭ является актуальной задачей современности.
  
  Цель — разработка методики выделения и получения первичных культур клеток РПЭ из донорских аутопсийных глаз взрослого человека.
  
  Материал и методы. Глазные яблоки 27 доноров энуклеировали через 20–24 ч после их exitus. Возраст доноров варьировался от 24 до 73 лет. Клетки РПЭ культивировали в пластиковых флаконах площадью 25 см².
  Глазные яблоки освобождали от остатков конъюнктивы и теноновой оболочки, промывали однократно в 70 % спирте и трижды в холодном растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков. Передний сегмент глаза удаляли, выполняя круговой разрез позади зубчатой линии, определяемой как граница между темным и светлым участками глаза. Стекловидное тело и нейральный отдел сетчатки отделяли от РПЭ и удаляли, подрезая нейральную сетчатку в области зрительного нерва. Выделенную глазную чашу наполняли холодным раствором Хэнкса с ЭДТА. Спустя 10–15 минут начинали процесс сборки клеток. На время изоляционной процедуры глазную чашу помещали в раствор Хэнкса и держали на льду. Визуальный контроль процесса осуществляли с помощью бинокулярной лупы.
  Клетки РПЭ осторожно отделяли от мембраны Бруха, проводя по слою и засасывая наконечником дозированной пипетки в 200 мкл. Собранные клетки центрифугировали 5 мин при 600 об/мин и ресуспендировали в полных культуральных средах двух составов. Клеточную суспензию одного глазного яблока из каждой донорской пары глаз ресуспендировали в среде №1, состоящей из питательной среды DMEM/F12, дополненной 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), добавки N2 и оФРФ. Клеточную суспензию, полученную из второго глазного яблока того же донора ресуспендировали в среде №2, состоящей из питательной среды DMEM/F12, дополненной 10 % ЭТС.
  
  Результаты и обсуждение. Использование ростовой среды №1 позволило получить стабильный конфлюэнтный монослой клеток РПЭ. Морфологические исследования культивированного РПЭ свидетельствовали о его жизнеспособности и пригодности к трансплантации. Количественный выход РПЭ при использовании выше указанной методики культивирования от культуры к культуре был стабилен, а объем РПЭ был достаточен для проведения экспериментальных или клинических исследований.
  
  Выводы. Разработанная методика выделения РПЭ взрослого человека позволяет получать клетки РПЭ в стабильном объеме, достаточном для проведения экспериментальных исследований. Описанная методика может быть рекомендована для получения РПЭ при подготовке к последующей трансплантации.