Рис. 1. В рисунке: флюорофоры; пиковая волна возбуждения; пиковая волна излучения. Липофусцин; роговица; хрусталик; зрительный нерв
Рис. 2. A – отличный сигнал; B – слабый сигнал. Длина волны возбуждения 488 нм (синий свет)
Для изображения аутофлюоресценции используются 256 оттенков шкалы серого цвета. Низкие значения пикселей означают гипофлюоресценцию и кажутся темными, тогда как высокие значения пикселей означают гиперфлюоресценцию и кажутся яркими. Сигнал аутофлюоресценции пропорционален концентрации обнаруженных флюорофоров.
В клинической практике аутофлюоресценцию используют для визуализации флюоресценции липофусцина в пигментном эпителии сетчатки. Липофусцин является индикатором здоровья пигментного эпителия. Здоровый пигментный эпителий сетчатки на снимках аутофлюоресценции изображается однородным серым цветом. В целом, гипераутофлюоресценция указывает на повреждение пигментного эпителия сетчатки, а гипоаутофлюоресценция указывает на мертвый пигментный эпителий или его отсутствие. Исследования показали, что изображения аутофлюоресценции эффективны в ранней диагностике нарушений пигментного эпителия при макулярной дегенерации и помогают прогнозировать прогрессирование географической атрофии (Sparrow J.R. et al., 2010; Holz F.G. et al., 2007). Метод аутофлюоресценции глазного дна информативен при дистрофиях сетчатки, а также при токсических ретинопатиях, например, вызванных применением гидроксихлорохина.
Флюорофоры
Находящийся в пигментном эпителии сетчатки липофусцин представляет собой основной макулярный флюорофор, который поглощает синий свет с пиковой длиной волны возбуждения 470 нм и излучает желто-зеленый свет с пиковой длиной волны 600–610 нм. Однако в глазу есть и другие флюорофоры, расположенные вне пигментного эпителия сетчатки: в роговице (с пиковой длиной волны возбуждения 365–480 нм и пиковой длиной волны излучения 620 нм [Van Schaik H.J. et al., 1999]) и в хрусталике (с пиковой длиной волны возбуждения 420–430 нм и пиковой длиной волны излучения 520 нм [Sparrow J.M. et al., 1992]). Кроме того, коллагены зрительного нерва также способны к аутофлюоресценции (с пиковой длиной волны возбуждения 446 нм и пиковой длиной волны излучения 500 нм [Schweitzer D. et al., 2007]) (рис. 1).
Основы флюоресценции
Рис. 3. В рисунке: Режим захвата изображений; диапазон длин волн возбуждения, диапазон длин волн детектора
Рис. 4. ZEISS CLARUS 500. Изображение в режиме FAF-Blue
Что определяет ZEISS CLARUS?
Диагностика зависит от многих факторов: пиковой длины волны возбуждения флюорофора, пиковой длины волны излучения флюорофора, длин волн освещения и диапазона детектора. ZEISS CLARUS излучает возбуждающий свет в двух диапазонах длин волн: FAF-Blue (435-500 нм) и FAF-Green (500–585 нм). Это позволяет обнаружить все флюорофоры, которые поглощают свет в этих диапазонах и излучают свет в пределах диапазона пропускания фильтра детектора, составляющего 532-650 нм для FAF-Blue и 630-750 нм для FAF-Green. Следовательно, изображения ZEISS CLARUS могут отличаться от изображений cSLO, которое определяет свет, излучаемый меньшим диапазоном флюорофоров (рис. 3).
Что определяет cSLO?
В cSLO используется конфокальная оптика с пространственной диафрагмой, которая улавливает свет из определенной оптической плоскости и устраняет свет, который находится не в фокусе (Sharifzadeh M. et al., 2006; Schweitzer D. et al., 2007). Конфокальная оптика работает только с ограниченной фокусной глубиной, что исключает флюоресценцию других структур за пределами фокальной плоскости, таких как хрусталик и головка зрительного нерва. Аппараты с конфокальным дизайном освещают сетчатку одной длиной волны, возбуждающей только те флюорофоры, которые поглощают свет с пиковым возбуждением около этой конкретной длины волны.
Различия между ZEISS CLARUS и cSLO
ZEISS CLARUS и cSLO имеют разные оптические конструкции и длины волн возбуждения, и это влияет на получаемые изображения флюоресценции. Основное отличие изображений аутофлюоресценции, полученных с помощью cSLO, связано с ограниченной глубиной фокусировки, которая исключает сигналы флюоресценции за пределами конфокальной плоскости.
ZEISS CLARUS, напротив, кроме флюоресценции пигментного эпителия сетчатки улавливает, например, флюоресценцию диска зрительного нерва благодаря освещению FAF-Blue, так как коллагены в диске зрительного нерва в этом режиме поглощают свет в диапазоне возбуждения (с длиной волны 446 нм) и излучают флюоресценцию в диапазоне обнаружения. cSLO из-за ограниченной фокусной глубины улавливает только минимальную флюоресценцию диска зрительного нерва. Хотя между двумя системами существуют некоторые различия, общая картина флюоресценции липофусцина с аппаратами ZEISS CLARUS и cSLO аналогична. Оба аппарата остаются полезными и клинически значимыми для обнаружения и оценки нарушений пигментного эпителия сетчатки.
Клинические примеры использования ZEISS CLARUS
Приведенные ниже изображения FAF-Blue были получены у одного и того же пациента с использованием аппарата ZEISS CLARUS 500 и коммерчески доступной системы cSLO. На изображениях ZEISS CLARUS четко видна флюоресценция зрительного нерва, а на изображениях системы cSLO – нет. Зрительный нерв на снимках выглядит по-разному, но обе системы определяют одну и ту же географическую атрофию в макуле.
Поскольку и FAF-Blue, и FAF-Green способны возбуждать липофусцин в пигментном эпителии сетчатки, оба типа сканирования можно использовать в клинической практике для оценки заболевания сетчатки, и они будут давать аналогичные изображения с точки зрения общих паттернов флюоресценции
В то же время между двумя режимами есть и определенные различия. Лютеиновые пигменты, обычно присутствующие в макулярной области, поглощают синий свет, что приводит к характерному снижению сигнала FAF-Blue в этой области. Поэтому область желтого пятна на изображениях FAF-Blue кажется гипофлюоресцентной. Этот эффект не виден на изображениях FAF-Green, поскольку лютеиновые пигменты не поглощают зеленый свет. Таким образом, на FAF-Green легче увидеть небольшие изменения в макулярной области. Кроме того, ядерная катаракта создает дополнительную флюоресценцию в синем свете, что может ухудшить качество изображения FAF-Blue. Следовательно, у пациентов с катарактой лучшие снимки можно получить, используя режим FAF-Green. Эффекты лютеинового пигмента и ядерной катаракты обусловлены длиной волны возбуждения синего спектра и могут наблюдаться как с cSLO, так и с ZEISS CLARUS.
Заключение
Особенности изображений аутофлюоресценции зависят от метода захвата изображений. ZEISS CLARUS использует метод широкополосной визуализации глазного дна, который освещает сетчатку и обнаруживает излучаемый ею свет в двух диапазонах длин волн. Следовательно, изображения ZEISS CLARUS будут отличаться от изображений cSLO, возбуждающей флюорофоры одной длиной волны и имеющей узкую глубину фокуса. Из-за этих различий диск зрительного нерва на изображениях ZEISS CLARUS выглядит светлым, а на изображении cSLO – темным.
Некоторым пациентам особенно полезным может стать режим аутофлюоресценции с использованием зеленого света, например, пациентам с катарактой или с начальной географической атрофией макулы. Возможность выбора оптимального режима формирования изображений (в зеленом или синем спектре) уникальна для платформы ZEISS CLARUS. Выявление более широкого диапазона аутофлюоресценции может помочь пациентам и клиницистам при дифференциальной диагностике глазных болезней.
https:/www.zeiss.com/content/dam/med/ref_international/products/retinal-cameras/clarus-700/pdf/clarus_white_paper_final_en_31_025_0268i_cam9724.pdf
