Биологическое действие низкочастотного ультразвука

Научное направление, объединяющее фундаментально-прикладные исследования влияния ультразвука (УЗ) при факоэмульсификации (ФЭ) на ткани глаза возможно одно из самых противоречивых в современной офтальмологии. Фабула интриги заключается в отсутствии строгого разграничения между интервенционным воздействием низкочастнотного УЗ и — совокупным влиянием фармакологических и хирургических факторов (механических, гидродинамических, термических и пр.), непосредственно связанных с технологическими этапами операции. При этом, если обратиться к базовым экспериментальным работам по общебиологическим эффектам ультразвука частотного диапазона, идентичного ФЭ, то обнаруживается целый пласт гистохимических, цитоспектрофотометрических и пр. исследований, демонстрирующих те или иные изменения на молекулярном и ультраструктурном уровне в биологических тканях, в том числе и в тканях глаза.
Анализ офтальмологических публикаций сводится к констатации базовой концепции о дозозависимой связи между УЗ и изменениями в тканях глазах: чем меньше интенсивность и продолжительность УЗ, тем в меньшей степени риск развития индуцированных изменений. В основе этой парадигмы целая серия экспериментально-клинических исследований, не утративших своей значимости поныне. Работами Ito K. (1970), Нарбута Н.П. (1975) была вскрыта корреляционная связь параметров УЗ и характером наступающих изменений в радужке и сетчатке. Лившиц С.А. (1998) экспериментально исследовал дозозависимый эффект выраженности морфологических изменений в стекловидном теле, радужке и трабекулярной зоне. В соответствии с определенной картиной минимальных изменений Золоторевским А.В. (1996) рекомендованы безопасные параметры ультразвука.
В современных факомашинах благодаря аппаратной и технической модернизации эффекты термического воздействия нивелированы; программное обеспечение позволяет модулировать режимы УЗ, уменьшающие эквивалент используемой мощности; сама же нынешняя хирургическая техника ФЭ максимально сохраняет целостность анатомо-топографических соотношений тканей глаза…
Следует ли из сказанного выше, что проблема исчерпана? И может быть следует просто благословить многочисленную армию молодых хирургов, которые сегодня с пылом неофитов осваивают премудрости ФЭ и завтра станут бескомпромиссными носителями этой методики для тысяч и тысяч больных? Мне представляется, и большинство со мной согласятся, что было бы неверным, говоря о ФЭ, ограничиваться ее хирургическим эффектом, который, несомненно, великолепен, но при этом оставлять в стороне малоизученные скрытые патофизиологические аспекты методики. Несомненно, целостность рассмотрения данного вопроса достижима в преемственности развития научных знаний, которые должны определять или, по крайней мере, предвосхищать тенденции практического (прикладного) развития метода.
Говоря формально, нельзя сбрасывать со счетов публикации последних лет, указывающие на развитие аппаратно диагностируемых субклинических, а в ряде случаев — клинических изменений в структурах глаза после неосложенной ФЭ (Biro Z,, Balla Z,, Kovacs B,, 2008, 2009; Degenring R.F., Vey S., Kamppeter B., 2006 и др.).
Данные публикации в контексте с продолжающейся модификацией факомашин, ориентированной на снижение УЗ и активным внедрением в клиническую практику альтернативной фемтолазерной хирургии катаракты, свидетельствуют о сохраняющейся актуальности проблемы изучения влияния УЗ на ткани глаза, т.к. даже минимальное воздействие УЗ обладает биологическими эффектами. Каковы же они?
С точки зрения фундаментальных основ общебиологического воздействия низкочастотного УЗ, его влияние на ткани глаза объясняется тем, что при ФЭ имеют место не только эффекты кавитации — видимые хирургом в окуляре операционного микроскопа коллапсирующие пузырьки воздуха эффекты кавитации, описанные в офтальмологической литературе как обуславливающие структурные морфологические повреждения тканей глаза, но и звукохимические реакции. Эти реакции индуцируются в биологических тканях на функциональном субклеточном уровне и могут обуславливать последующее развитие их морфофункциональной декомпенсации .
Экспериментально доказано, что порог возникновения внутриклеточных звукохимических реакций, составляет всего 0,02-0,04 Вт/см²; а для эмульсификации двух сред масло-вода при частоте УЗ 40 кГц необходима интенсивность не менее 0,3-0,4 Вт/см²! Конечно при всей наглядности, данное сопоставление требует определенной корректировки по экспозиции, параметрам УЗ-контура, температурным условиям и т.д.
В основе возникновения звукохимических реакций — эффекты пороговой кавитации, при которых коллапсирующие микрополости (размерами в несколько микрон) нарушают биомолекулярные связи . При трансмиссионном исследовании было выявлено, что при слабых интенсивностях низкочастотного УЗ повреждается структура внутриклеточных органелл — комплекса Гольджи, рибосом .
Под низкочастотным ультразвуком подразумевают упругие колебания с частотой от 15 до 100 кГц. Известные факоэмульсификаторы работают в нижней части указанного диапазона.
Для оценки воздействия ультразвука на исследуемый объект в клинической медицине пользуются определением «интенсивность звука», которая измеряется в ваттах на квадратный сантиметр — Вт/см². Следует отметить некоторую противоречивость позиции клиницистов-офтальмологов, которые в качестве оценки степени воздействия ФЭ опираются на аппаратные показатели мощности, выраженные в процентах. Ошибка кроется в том, что на дисплее аппарата указывается процентный эквивалент от условной 100% мощности генератора УЗ; генерируемые импульсы передаются на преобразователь (пьезоэлектрический или магнитострикционный), КПД которого колеблется в достаточно большом диапазоне (от 40 до 70%), поэтому предлагаемые рядом авторов расчеты «абсолютных» параметров мощности, передаваемой непосредственно в полость глаза, от исходной аппаратной мощности генератора УЗ представляются весьма условными .
Биологическое действие УЗ в зависимости от уровня интенсивности складывается из механических, тепловых и физико-химических факторов. К механическим факторам относят давление, акустические течения и колебательные смещения частиц. Тепловой эффект обусловлен классическим превращением звуковой энергии в тепловую.
Кавитация является ведущим фактором, обуславливающим акустически вызванные изменения в биологической ткани и, в частности, при ФЭ — в глазу . Кавитация вызывает структурные повреждения, детерминирует звукохимические реакции и возникновение новых, не свойственных данному объекту, биохимических реакций .
Кавитация (стабильная и коллапсирующая) представляет собой образование и схлопывание (захлопывание) пузырьков из растворенных в жидкости газов. Кавитационные пузырьки образуются, когда давление в жидкости становится ниже критического значения, соответствующего порогу кавитации.
Водные растворы имеют низкий уровень возникновения кавитации из-за наличия в них зародышей кавитации — микроскопических газовых пузырьков (235). Микроскопический пузырек, попадая в зону пониженного давления в звуковой волне, теряет свою устойчивость и быстро увеличивается в объеме в результате того, что давление содержащегося в нем газа и пара оказывается превосходящим суммарное действие поверхностного натяжения и давления в жидкости. В полупериод увеличения давления в упругой волне происходит сжатие пузырьков с резким увеличением давления в его полости, в результате чего кавитационная полость схлопывается. Схлопывание сопровождается разрывом молекулярных связей воды на свободные радикалы ОН и Н, что является первопричиной окисляющего действия УЗ.
Пузырьки воздуха наносят ущерб эндотелию, который складывается из гидродинамических (травмы ударными микропотоками) и звукохимических факторов (нарушение клеточных структур в результате усиления свободнорадикального окисления липидов).
Экспериментально установлено, что при частоте 30 кГц пороговое значение интенсивности, при котором возникает кавитация, составляет 0,1-0,2 Вт/см² (Кнэпп Р., Дейли Дж., Хэммит Ф., 1974). Причем величина кавитационных пузырьков может составлять доли мкм, что объясняет отсутствие их визуализации при ФЭ (Haar G.R., Saksena T.K., 1984).
При трансмиссионном исследовании было выявлено, что при слабых интенсивностях низкочастотного УЗ нарушается структура внутриклеточных органелл — комплекса Гольджи, рибосом .
Любопытный факт. Экспериментально установлено, что для эмульгации сред масло-вода при частоте УЗ 40 кГц требуется интенсивность не менее 0,3-0,4 Вт/см²; (Ультразвук…, 1979). Очевидно, что вещество хрусталика имеет более плотную консистенцию, чем масло и, следовательно, для ее эмульгации необходима интенсивность выше указанной. Кроме того, установлено, что нижняя граница возникновения видимой кавитации в воде составляет 0,1-0,2 Вт/см²; (К.Хилла, 1989). При факоэмульсификации хирург уже визуализирует возникновение кавитационных пузырьков при использовании нижних значений мощности аппарата (интенсивности УЗ). Журавлев А.И. и Акопян А.Б. (1977) с помощью высокочувствительного метода электрической регистрации показали, что нижний порог развития звукохимических реакций при использовании низкочастотного УЗ составляет 0,01-0,03 Вт/см².
Любопытный факт: экспериментально установлено, что для эмульгации сред масло-вода при частоте УЗ 40 кГц требуется интенсивность УЗ не менее 0,3-0,4 Вт/см² ; при этом Журавлев А.И. и Акопян А.Б. (1977) с помощью высокочувствительного метода электрической регистрации показали, что для развития звукохимических реакций требуется интенсивность УЗ в десятки раз меньше. Очевидно, что вещество хрусталика имеет более плотную консистенцию, чем масло и, следовательно, для ее эмульгации необходима интенсивность выше указанной.
Данные литературы указывают, что при минимальных значениях интенсивности запускаются звукохимические реакции, вызывающие обратимые изменения. При повышении УЗ-интенсивности внутриклеточные изменения усугубляются и переходят в структурные нарушения. Главным патогенетическим фактором этих реакций является кавитация.
Думброва Н.Е. (1988) указывает, что традиционные методы морфологических исследований не выявляют первичные механизмы УЗ-воздействия. Для их выявления необходимо проведение специальных ультратонких исследований, отражающих функциональное состояние клетки
Основные факторы УЗ-воздействия влияют в первую очередь на внутриклеточные и клеточные мембранные образования. Изменение клеточных мембран под действием ультразвука в свою очередь ведет к изменению проницаемости, следовательно, концентрации различных веществ в клетке и — во внеклеточном пространстве. В ответ на это в клетке запускаются репаративные процессы. Характер регуляторных и репаративных процессов в клетках обуславливается степенью изменения состава внутриклеточной среды, и следовательно, степенью изменения проницаемости клеточных мембран, в свою очередь зависящей от длительности и интенсивности УЗ-воздействия (Saksena T.K., Nyborg W.L., 1981).
Брагинская Ф.И. (1981) показала, что повреждения низкомолекулярных соединений, адеиновых производных нуклеиновых кислот, цитохрома С могут быть полностью обусловлены химическим эффектом УЗ, т.е. звукохимическими реакциями, а деструкция макромолекул (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды миозина) и клеток связана с влиянием механического фактора кавитации. Чем выше молекулярный вес макромолекулы и чем симметричней ее структура, тем в большей степени она подвержена механической деструкции.
Исследование АТФ-азной активности клетки является наиболее объективным методом, позволяющим оценить выраженность воздействия на нее различных внешних факторов.
Аденозинтрифосфат (АТФ) играет исключительно важную роль в энергетическом обмене клетки; АТФ источник энергии для всех внутриклеточных биохимических процессов, поэтому АТФ образно называют «универсальной валютой», которой клетки расплачиваются за все свои энергетические расходы. В кристы митохондрий встроены ферменты, которые обеспечивают преобразование энергии питательных веществ, поступающих в клетку извне, в энергию молекул АТФ. Митохондрии специализируются на синтезе АТФ путем транспорта электронов и окислительного фосфолирирования. Митохондрии — это «энергетические станции» эукариотических клеток.
В 2000г. нами совместно с зав. Лабораторией жизнедеятельности клетки проф. Дыбенко (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН ) и вед. научным сотрудником лаборатории клеточной морфологии к.б.н. Л.Э. Завалишиной (НИИ Онкологии им.Герцена) был проведен эксперимент по изучению влияния УЗ при ФЭ на ткани глаза. Принимая во внимание технические отличия аппаратов с современными приборами предлагается сравнительный анализ качественных изменений морфологической картины тканей глаза после ФЭ без использования УЗ (факоаспирация) и при его минимальных значениях (фиксировано 10% от максимальной мощности, экспозиция 30 сек)
В качестве субмикроскопической структуры — объекта исследования — нами была выбрана внутриклеточная ферментная система фоторецепторов, являющаяся универсальным показателем их функционального состояния.
Анализ патоморфологических изменений был произведен на основании изучения светооптических препаратов и ультратонких срезов методом электронной цитохимии (реакция на выявление активности АТФ-азы).
Приготовление светооптических препаратов выполнено по методике фиксации Ito M. & Karnovsky (1981) с использованием заливочной среды GB-4. Световые препараты анализировали на световом фотомикроскопе Opton-3. Приготовление ультратонких срезов оболочек глаза осуществляли по методу Reynolds [1963]. Выявление АТФ-азной активности в субклеточных структурах сетчатки проводили по методу Shulze W. [1971]. Срезы исследовались в электронном микроскопе GEM 100B.
В материале, полученном в 1-й серии эксперимента (6 глаз кроликов, без использования УЗ), ультраструктура фоторецепторов была сохранной и характеризовалась присутствием во внутренних сегментах палочек и колбочек субмикроскопически сохранных и единичных деструктивно измененных митохондрий. Подобная разница в морфологическом состоянии митохондрий является физиологической и отражает постоянно происходящее обновление мембран наружных сегментов [Франк Г.М., 1964].
Специфическое мечение присутствовало в ядросодержащих и внутренних сегментах фоторецепторов. В ядросодержащих сегментах метка локализовалась в листках кариолеммы и нередко занимала значительные ее участки, отдельные включения метки обнаруживались и в кариоплазме. Мечение на АТФ-азу во внутренних сегментах было характерно для матрикса митохондрий.
Наружные сегменты фоторецепторов метки не содержали. Для их ультратонкой организации были характерны сохранность внешней, ограничивающей мембранные диски, части цитолеммы фоторецепторов, наличие отдельных расширенных и вакуолизированных мембранных дисков.
В условиях воздействия ультразвуком (6 глаз) в фоторецепторах сетчатой оболочки целостность цитолеммы, покрывающей наружные сегменты, была нарушена, отмечалась вакуолизация и признаки деструкции мембранной структуры эндотелиальных клеток, увеличение межклеточных промежутков, образование внутриклеточных вакуолей и отшнуровка мембранных везикул в переднюю камеру глаза. Выявлялись выраженные признаки деструкции клетки в виде участков клеточного детрита.
Сопоставление выявленных субмикроскопических признаков указывает на возникающую в результате ультразвукового воздействия деструкцию мембранного аппарата наружных сегментов фоторецепторов.
Для ультраструктуры внутренних сегментов была характерна высокая степень электронной плотности цитозоля и более компактное расположение в сегментах митохондрий. Большинство митохондрий имели более плотный матрикс и компактную упаковку крист, что свидетельствует о снижении их функциональной активности [Думброва Н.Е., 1988]. Встречались митохондрии и с признаками тотального разрушения внутренней структуры с отеком и полным разрушением крист. Характерным было отсутствие специфического мечения митохондриального матрикса. Метка не обнаруживалась и на мембранах комплекса Гольджи.
АТФ-азу следует рассматривать как маркер, активность которого остается сохранной при механической хирургической травме и селективно подавляется в условиях УЗ-воздействия с последующим нарушением в функционировании и физиологическом восстановлении субмикроскопических структур фоторецепторов.
Таким образом, можно утверждать, что один из возможных эффектов ультразвука связан с нарушением морфофункциональной организации всей внутриклеточной мембранной системы фоторецепторов. Маркерами этих нарушений является субмикроскопическая картина и отсутствие специфического мечения на АТФ-азу. При этом, патоморфологическая оценка воздействия УЗ на сетчатую оболочку глаза возможна только при субмикроскопическом исследовании препаратов. Данные световой микроскопии малоинформативны.
Полученные результаты могут быть использованы для понимания механизмов развития аппаратно диагностируемых изменений структур глаза.