Рис. 1. Клинический пример №1: а) глазное дно пациентки Б., б) ультразвуковая картина опухолевого очага и отслойки сетчатки с субретинальным включением; в, г) ОКТ-снимки отслойки с субретинальными включениями
Fig. 1. Case №1: a) fundus examination picture of patient B.; б) retinal detachment with subretinal inclusions; в, г) OCT scans of retinal detachment with subretinal inclusions
Рис. 2. Цитологическая картина увеальной меланомы веретеноклеточного типа — материал ТИАБ
Fig. 2. Cytology of spindle cell uveal melanoma — FNAB sample
Актуальность
Несмотря на прогресс в разработке методов лечения первичной опухоли, высокий уровень локального контроля и множество предложенных методов лечения метастазов, показатели выживаемости пациентов с метастатической увеальной меланомой (УМ) не изменились за последние 50 лет [1]. Это свидетельствует о высокой актуальности проблемы и необходимости разработки комплексной системы прогнозирования пациентов с УМ с учетом клинических, морфологических и молекулярно-генетических факторов.
Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) УМ рутинно используется в мировой практике для определения риска развития метастазов у таких пациентов и обладает высокой информативностью в выявлении морфологических и молекулярно-генетических изменений [2].
При этом определенную диагностическую и прогностическую ценность могут представлять методы жидкостной биопсии в различных биологических средах [3]. Такая технология характеризуется минимальной инвазивностью, однако предполагает крайне малое количество опухолевого материала, которое может не отражать истинную мутационную картину первичного опухолевого очага. Данные об анализе субретинальной жидкости (СРЖ) при ТИАБ УМ в литературе отсутствуют, однако исследование СРЖ может расширить имеющиеся представления о биологии УМ и дополнить информативность ТИАБ.
Цель
Разработать технологию и оценить возможности биопсии СРЖ как альтернативы пункции УМ.
Материал и методы
Эксперимент по проведению ТИАБ СРЖ проводился на 28 энуклеированных глазах с УМ. В рамках эксперимента разрабатывались хирургическая методика получения СРЖ и необходимый инструментарий, а также оценивался ее потенциал с точки зрения информативности материала.
Средняя высота проминенции опухоли в энуклеированных глазах, по данным В-сканирования, составила 9,6 мм (min 3,1 мм, max 14,8 мм), средний размер основания по наибольшему значению — 15,1 мм (min 10,1 мм, max 20,3 мм), средняя высота отслойки сетчатки — 5,4 мм (min 1,5 мм, max 12,6 мм).
Хирургическая техника ТИАБ СРЖ имеет ряд особенностей, отличающих ее от ТИАБ опухолевого очага.
В первую очередь они обусловлены различием в плотности субретинального содержимого и собственно ткани опухоли. При попытке введения инструмента (иглы, соединенной с аспирационной системой) в зону экссудативной отслойки сетчатки ее перфорация представляется невозможной ввиду слабого обратного механического сопротивления со стороны субретинального содержимого. С целью создания ретинального дефекта, через который впоследствии возможна аспирация СРЖ, сетчатка надсекалась с помощью эндовитреальных ножниц. В качестве альтернативного способа возможна фиксация сетчатки при помощи эндовитреального пинцета с последующим введением биопсийной иглы в зону СРЖ, однако этот способ является более травматичным с точки зрения механического воздействия на сетчатку. Наиболее щадящим, но также технически трудноосуществимым, является введение иглы в паратуморальную зону, где отслойка сетчатки распространяется по склонам новообразования сосудистой оболочки, имеет наибольшее натяжение и напряжение.
Определение мутаций в генах GNAQ и GNA11, «драйверных» и наиболее распространенных мутаций УМ, проводилось методом супер-аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Также оценивалась концентрация ДНК в образцах ТИАБ СРЖ, ТИАБ опухолевого очага и по гистологическому материалу с парафинового блока. ДНК выделяли с помощью набора реагентов ExtractDNA FFPE (ЗАО «Евроген», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
Материал ТИАБ СРЖ оценивался во всех 28 образцах (100%), материал ТИАБ опухолевого очага — в 23 образцах (82%), гистологический материал парафиновых блоков — в 9 образцах (32%). Результаты представлены в таблице.
В рамках проведенного эксперимента информативность ТИАБ СРЖ составила 32% (9 информативных образцов), ТИАБ опухолевого очага — 91% (21 информативный образец), гистологического материала — 100% (9 информативных образцов).
Средняя концентрация ДНК в образцах ТИАБ СРЖ составила 1,15 нг/мл, ТИАБ опухоли — 20,67 нг/мл, в гистологическом материале — 106,8 нг/мл. Примечательно, что в 43% случаев (n=10) концентрация ДНК в материале ТИАБ СРЖ была выше, чем в материале ТИАБ опухоли, что, однако, не влияло на итоговую информативность материала. Уровень концентрации ДНК в материале ТИАБ СРЖ был ожидаемо и статистически значимо ниже в сравнении с образцами гистологического материала (p<0,01, критерий Уилкоксона), однако при сравнении с концентрацией ДНК в материале ТИАБ опухолевого очага разница не была статистически значимой (p=0,27, критерий Уилкоксона).
Апробация методики
Клинический пример №1. Пациентка Б., 47 лет, обратилась к нам в клинику с жалобами на снижение зрения и появления шторки. При обследовании был визуализирован беспигментный грибовидный опухолевый очаг (рис. 1 а), наибольшая проминенция которого, по данным В-сканирования, составила 8,8 мм, протяженность — 11,7 мм. Офтальмоскопически визуали
Рис. 3. Цитологическая картина субретинальной жидкости, не содержащей опухолевые клетки
Fig. 3. Cytological examination of subretinal fluid sample with no tumor cells
Рис. 4. Клинический пример №2: а) глазное дно пациента Б.; б) ультразвуковая картина опухолевого очага и отслойки сетчатки с субретинальным включением; в, г) ОКТ-снимки отслойки с субретинальными включениями
Fig. 4. Case №2: a) fundus examination picture of patient B.; б) retinal detachment with subretinal inсlusions; в, г) OCT scans of retinal detachment with subretinal inсlusions
Проведена ТИАБ как опухолевого очага, так и зоны отслойки сетчатки с СРЖ, подозрительной по содержанию на опухолевые клетки. ТИАБ опухолевого очага проводилась по стандартному алгоритму, при ТИАБ СРЖ введение иглы осуществлялось в паратуморальную зону, где отслойка сетчатки распространялась по склонам новообразования сосудистой оболочки и имела наибольшее натяжение и напряжение. Согласно полученным результатам цитологического исследования материала внутриглазного очага, обнаружены клетки веретенообразной (более 90%) и округлой (менее 10%) формы c пигментированной цитоплазмой формы, что соответствует картине веретеноклеточной меланомы (рис. 2).
Диагноз УМ был также подтвержден при проведении молекулярно-генетического тестирования — выявлена мутация c.626A>T, p.(Gln209Leu, Q209L) в экзоне 5 гена GNA11. При этом цитологическое исследование СРЖ выявило многочисленные клетки пигментного эпителия и немногочисленные макрофаги, клетки злокачественной опухоли не обнаружены (рис. 3).
Кроме того, в материале СРЖ мутаций в «горячих точках» экзона 5 гена GNAQ и экзона 5 гена GNA11 не обнаружено.
Клинический пример №2. Пациент К., 65 лет, был направлен в МНТК МГ г. Москвы с выпадением поля зрения. При обследовании был выявлен внутриглазной пигментированный опухолевый очаг проминенцией 7,1 мм и протяженностью 10,8 мм. Также визуализировалась высокая экссудативная отслойка сетчатки (5,2 мм, по данным В-сканирования) с субретинальными пигментированным включениями, подозрительными на опухолевые (рис. 4).
Проведена ТИАБ как опухолевого очага (по стандартной методике), так и зоны отслойки сетчатки с СРЖ через предварительно сформированную с помощью эндовитреальных ножниц насечку в сетчатке в зоне обширной экссудативной отслойки.
Согласно полученным результатам цитологического исследования, в материале СРЖ обнаружено 10% веретенообразных клеток с пигментированной цитоплазмой, что соответствовало цитологической картине УМ (рис. 5), а материал, полученный из опухолевого очага, оказался неинформативен. При это мутаций в генах GNAQ/11 обнаружены не были.
Обсуждение
В настоящее время биопсия УМ может быть проведена при выполнении забора внутриглазного очага и получении непосредственно опухолевого материала, а также при проведении жидкостной биопсии.
В отличие от традиционных методов, набирающая популярность жидкостная биопсия обеспечивает минимально инвазивный способ получения опухолевых клеток и генетического материала опухоли, а также получение материала в случаях, когда биопсия основного опухолевого очага невозможна. Жидкостная биопсия, по ряду исследований, позволяет выявлять и контролировать прогрессирование заболевания, рецидивы и реакцию на лечение и потенциально дополнять биопсию опухолевого очага [3]. При этом принцип жидкостной биопсии основан на получении из жидкостей организма структур опухолевого происхождения. К ним относятся циркулирующие опухолевые клетки, циркулирующая опухолевая ДНК, бесклеточная микроРНК, а также внеклеточные опухолевые везикулы. Например, слюна может быть использована при опухолях головы и шеи, моча — при раке мочевого пузыря, спинномозговая жидкость — при опухолях ЦНС [4].
В офтальмологии для получения материала могут быть использованы стекловидное тело и влага передней камеры. Так, J.L. Berry и соавт. предложили выполнять забор влаги передней камеры в качестве альтернативы обычной биопсии ретинобластомы в тех случаях, когда ее проведение невозможно. Кроме того, забор влаги при ретинобластоме считается более безопасной манипуляцией по сравнению с классической ТИАБ [5]. Позже теми же авторами результаты были дополнены с точки зрения возможности использования влаги передней камеры как предиктора неблагоприятного клинического исхода и более слабого ответа опухоли на проводимую терапию в случае выявления увеличения ×6 [6]. Забор стекловидного тела, по данным литературы, весьма информативен при внутриглазной лимфоме [7]. Работы, посвященные биопсии стекловидного тела и влаги передней камеры при УМ, единичны, особенно по сравнению с работами, где жидкостная биопсия проводится на периферической крови пациентов, что связано с преимущественно гематогенным путем диссеминации опухоли.
Так, Sakuma и соавт. использовали внутриглазную жидкость с диагностической целью для установки диагноза УМ, который был верифицирован путем визуализации атипичных опухолевых клеток с гранулами меланина при проведении цитологического исследования и окраской препаратов по Шорру [8]. Ряд авторов предлагали использовать определение VEGF-факторов во влаге передней камеры и стекловидном теле, что может коррелировать с большими размерами опухоли, гистологическим типом и неблагоприятным прогнозом [9, 10]. Определение уровня HLA может также коррелировать с размерами опухоли и выживаемостью [11]. Анализ мутаций в генах GNA11/Q, как правило, проводится на материале УМ, при эт
Рис. 5. Цитологическая картина увеальной меланомы веретеноклеточного типа — материал СРЖ
Fig. 5. Cytology of spindle cell uveal melanoma — subretinal fluid sample
Таблица Информативность и концентрация ДНК в образцах
Table DNA informativeness and concentration in samples
Уступающая информативность биопсии СРЖ гистологическому и цитологическому материалу не должна становиться ограничением в использовании данной методики ввиду узких показаний к ее использованию — необходимость забора СРЖ в селективных случаях, когда иные методики недоступны или требуется оценка обсемененности СРЖ. Полученные данные и информация из литературы указывают на необходимость дальнейших малоинвазивных исследований УМ.
Заключение
Разработанная технология биопсии СРЖ может быть использована как альтернатива пункции УМ, в том числе для оценки обсемененности субретинального пространства. Необходимо дальнейшее исследование предложенной методики.
Информация об авторах
Вера Андреевна Яровая, к.м.н., врач-офтальмолог отделения офтальмоонкологии и радиотерапии ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, verandreevna@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8937-7450
Андрей Ростиславович Зарецкий, начальник отдела молекулярных технологий НИИ трансляционной медицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, a-zaretsky@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-7778-6617
Антон Сергеевич Алексеев, врач-ординатор ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, Fxmrufer00@yandex.ru, https://orcid.org/0009-0003-7714-4088
Христо Периклович Тахчиди, д.м.н., профессор, академик РАН, проректор по лечебной работе, директор Научно-исследовательского центра офтальмологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова, hpt1301@gmail.com, https://orcid.org/0009-0000-3545-9899
Information about the authors
Vera A. Yarovaya, PhD in Medicine, Ophthalmologist of the Ocular Oncology and Radiology Department of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, verandreevna@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8937-7450
Andrey R. Zaretskiy, Head of molecular technology department of Research Center translational medicine of Pirogov Russian National Research Medical University, a-zaretsky@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-7778-6617
Anton S. Alekseev, Clinical Resident of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Fxmrufer00@yandex.ru, https://orcid.org/0009-0003-7714-4088
Khristo P. Takhchidi, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Academician of RSA, Director of Ophthalmology Research Center of Pirogov Russian National Research Medical University, hpt1301@gmail.com, https://orcid.org/0009-0000-3545-9899
Вклад авторов в работу:
В.А. Яровая: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
А.Р. Зарецкий: существенный вклад в анализ и обработку материала.
А.С. Алексеев: написание текста, обработка материала.
Х.П. Тахчиди: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Authors’ contribution:
V.A. Yarovaya: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material, editing, final approval of the version to be published.
A.R. Zaretskiy: significant contribution to analysis and processing of the material.
A.S. Alekseev: collection, processing of the material, writing.
K.P. Takhchidi: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.
Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.
Поступила: 04.05.2025
Переработана: 13.07.2025
Принята к печати: 29.07.2025
Originally received: 04.05.2025
Final revision: 13.07.2025
Accepted: 29.07.2025
С Новым годом!
