Болезнь Штаргардта. Этиопатогенетические особенности заболевания. Возможности клинической и молекулярно-генетической диагностики (обзор литературы)

Среди всей глазной патологии в различных популяциях РФ наследственно обусловленные нозологические формы занимают от 42 до 50% случаев [6, 8]. По мнению ряда авторов, болезнь Штаргардта (БШ) является одной из наиболее распространенных центральных наследственных макулярных дистрофий и составляет до 7% всех ретинальных дистрофий [22].

Интерес к изучению данного заболевания обусловлен, прежде всего, социальной значимостью, поскольку заболевание приводит к инвалидности в детском и юношеском возрасте [5]. БШ, как правило, диагностируется на первом или втором десятилетии жизни. Помимо снижения зрения, у пациентов отмечается появление центральных скотом, нарушение цветного зрения, изменение фотопических компонентов электроретинографии (ЭРГ). Клинически БШ характеризуется развитием атрофии фоторецепторного слоя и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) в макулярной области с характерным металлическим блеском, отсутствием макулярного и фовеального рефлексов (рис. 1а) [3, 4].

БШ отличается клиническим полиморфизмом и генетической гетерогенностью (табл. 1). Установлены 4 генетических варианта с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типом наследования [29, 35].

Усовершенствование ранней дифференциальной диагностики клинико-генетических вариантов БШ, систематизация функциональных симптомов по данным современных клинических и молекулярно-генетических методов диагностики до сих пор остаются одним из нерешенных вопросов офтальмологии.

Этиопатогенетические особенности заболевания

По данным зарубежных авторов, мутации в гене ABCR определяют от 60 до 80% случаев БШ. На сегодня картировано более 21 частых мутаций в этом гене, и на сегодня наиболее часто среди пациентов с болезнью Штаргардта встречаются мутации A1038V и G1961G [19, 29]. В этой связи, по нашему мнению, актуально изучение особенностей спектра и частоты встречаемости мутаций гена ABCR, приводящих к БШ в популяциях Российской Федерации.

Ген ABCR располагается в хромосомном регионе 1р22.1-р21, состоит из 50 экзонов, кодирует 2273 аминокислоты и имеет протяжённость ?150 kb [11].

Белок ABCR относится к большому классу трансмембранных белков –АТФ-связывающих кассетных переносчиков, которые используют энергию АТФ для переноса различных субстратов – от ионов до липидов и белков – через клеточную мембрану [11].

С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и вестерн-блоттинг-анализа показано, что, помимо палочек, ген ABCR экспрессируется в фовеальных и перифовеальных колбочках, в связи с чем полагают, что потеря центрального зрения при болезни Штаргардта может быть прямым следствием фовеальной колбочковой дегенерации, вызванной мутациями гена ABCR [26].

Дефект белка ABCR приводит к уменьшению или потере его способности активно удалять из фоторецепторной мембраны диска свободный транс-ретиналь, высвободившийся в результате фотолиза родопсина. Это приводит к накоплению транс-ретиналя в мембране и последующему взаимодействию двух его молекул с фосфатидилэтаноламином [33].

Образовавшийся таким образом бис-ретиналиден-фосфатидилэтаноламин, вероятно, сам по себе фототоксичен, но, что более существенно, он служит предшественником основного фототоксичного флуорофора липофусциновых гранул (ЛГ) – А2Е. ЛГ накапливаются в клетках ретинального пигментного (РПЭ) эпителия и являются источником аутофлуоресценции [7, 10, 12, 16]. Вместе с тем механизм и особенности развития патологического процесса при БШ более сложные, имеют каскадный характер и требуют дальнейшего детального изучения.

Современные клинические методы исследования

Помимо стандартных методов обследования пациентов с подозрением на БШ (визометрия, статическая периметрия, топография контрастной чувствительности, пространственная контрастная чувствительность, определение цветового зрения, комплекс электрофизиологических методов, флуоресцентная ангиография), функциональные характеристики которых хорошо описаны многими авторами [2, 3, 18], в настоящее время все чаще используются офтальмологами результаты оптической когерентной томографии (ОКТ) и аутофлуоресценции (АФ) глазного дна [9, 32]. Однако в литературе встречаются лишь единичные сообщения о результатах исследований пациентов с БШ методом ОКТ, который внедрен в практическую работу начиная с 90-х гг. ХХ в. [9, 20, 30].

ОКТ высокого разрешения позволяет в естественных условиях дифференцированно оценивать состояние слоев сетчатки и обнаруживать микроструктурные изменения. Это дает возможность проводить генотипическую/фенотипическую корреляцию и наблюдать за развитием патологического процесса [20, 24].

Кроме качественного анализа, ОКТ позволяет провести количественную оценку толщины фовеа у пациентов с БШ: истончение сетчатки в области фовеа и уменьшение тотального макулярного объема. Толщина фовеа варьирует от 119,0 [13] до 160 микрон [27].

Изменение структуры сетчатки в фовеоле при БШ заключалось в потере фовеальной двухслойности в проекции структур «наружные сегменты фоторецепторов – пигментный эпителий сетчатки», их уплотнения вплоть до полного исчезновения или остаточного гиперрефлективного узелка (рис. 1б) [9, 20].

Другим современным не инвазивным методом визуализации изменений на глазном дне является регистрация аутофлуоресценции (АФ). Известно, что основным источником АФ с глазного дна служит ЛГ РПЭ. При возбуждении в ультрафиолетовом или синем свете ЛГ показывают характерную АФ. Интенсивность АФ глазного дна – приблизительно на два порядка ниже величины фона флуоресцииновой ангиограммы в самой интенсивной фазе транзита краски. Распределение АФ примерно соответствует распределению фоторецепторов (рис. 2) [15].

При динамическом наблюдении яркий сигнал аутофлуоресценции может исчезнуть, поскольку развивается РПЭ (рис. 1в).

Chen B. и соавт. проводили исследование пятидесяти двух пациентов с БШ, имеющих различные стадии заболевания, и установили, что средняя скорость прогрессии атрофического процесса в макулярной области составила около 0,94 мм?/год [14].

Таким образом, метод регистрации АФ и ОКТ позволяют на более ранних этапах обнаруживать патологические изменения в макулярной зоне. Однако особенности АФ- и ОКТ-изображений, характерные для различных генетических вариантов БШ, на сегодня мало изучены, что связано с отсутствием четких клинических критериев диагностики этого заболевания.

Молекулярная диагностика

Принято считать, что наиболее достоверным методом диагностики БШ является молекулярно-генетический анализ. Важно отметить, что ДНК-диагностика БШ позволяет обнаружить мутации в пресимптоматическом периоде [6].

В настоящее время в литературе в основном описаны однонуклеотидные замены, приводящие к миссенс-мутациям в компаунд-гетерозиготном или гомозиготном состоянии, которые приводят к потере функции белка ABCR [28, 31].

Высокий уровень полиморфизма мутаций является определяющим фактором популяционной вариабельности аллелей и обусловливает необходимость детального изучения всего гена.

В настоящее время в мировой практике генетическая диагностика БШ основывается на одновременном использовании нескольких способов поиска мутаций в гене ABCR.

Для однозначной диагностики природы заболевания используют прямое автоматическое секвенирование проблемных генов, которое позволяет для каждого пациента выявлять все присутствующие мутации. Однако в связи с тем, что длина гена АВСR, имеющего экзон-интронную структуру, составляет около 150 тыс. пар оснований, проведение молекулярного сканирования экзонов является достаточно трудоемкой и дорогостоящей процедурой, несмотря на революцию последних лет в методах секвенирования ДНК [17].

Для снижения материальных затрат пациента исследование можно начинать с поиска наиболее частых мутаций в гене ABCR. Сегодня в РФ используются статистические данные спектра частых мутаций по данным зарубежных авторов. Это обусловливает актуальность поиска спектра мутаций в популяциях Российской Федерации.

В то же время для молекулярной диагностики мутаций в гене ABCR широко используют метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) [1]. В методе ПДРФ исследуемые экзоны гена ABCR амплифицируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), затем продукты амплификации обрабатываются определенными эндонуклеазами (рестриктазами), и полученные фрагменты ДНК анализируются с помощью гель-электрофореза. При этом рестриктазы подобраны таким образом, что присутствие мутаций вызывает появление или исчезновение сайтов расщепления [1].

Для высокопроизводительного скрининга в настоящее время широко применяется так называемое мини-секвенирование с помощью ДНК-чипов или ДНК-массивов (DNA arrays). Для выявления мутаций и полиморфизмов в гене ABCR с помощью этого метода был разработан специальный чип ABCR400 [21].

Один такой ДНК-чип позволяет определить более 500 однонуклеотидных замен в гене ABCR. Для более детального исследования после гибридизации на чипе выявляют проблемные экзоны и проводят их секвенирование [23].

Наконец, для детекции однонуклеотидных замен может быть использован еще один весьма эффективный современный метод – ПЦР в режиме реального времени.

Основным инструментом детекции в ПЦР в режиме реального времени является так называемый зонд – меченный флуоресцентным красителем и тушителем флуоресценции олигонуклеотид, обеспечивающий увеличение интенсивности флуоресценции по мере накопления ПЦР-продукта. Одним из самых употребительных типов зондов являются так называемые «молекулярные маяки» («molecular beacons») [25, 34].

Детекция однонуклеотидных замен с помощью «молекулярных маяков» с экономической точки зрения наиболее выгодна по сравнению с другими методами. Важной характеристикой метода «молекулярных маяков» является возможность проведения анализа в мультиплексном режиме. Это значит, что в одной пробирке можно анализировать продукты ПЦР с помощью нескольких (в зависимости от типа прибора – до шести) ДНК-зондов.

Заключение

Разработка диагностических критериев на основе ОКТ, АФ, ДНК-диагностики у пациентов с БШ с дальнейшим проведением генотипической/фенотипической корреляции, а также выявление спектра и частоты встречаемости мутаций гена ABCR в популяциях Российской Федерации являются актуальными проблемами современной офтальмологии.