Эффективность клеточных технологий в хирургическом лечении эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы (экспериментальное исследование)

    Актуальность

    Эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы представляет собой тяжелое, прогрессирующее заболевание, обусловленное декомпенсацией эндотелиального слоя роговой оболочки и являющееся одним из основных показаний к кератопластике в мире.

    В консервативном лечении ЭЭД с целью уменьшения отека роговицы используются кератопротекторы и метаболические средства, лазерная терапия, аутогемотерапия, лечебные контактные линзы. Однако фармакотерапия оказывает лишь кратковременный положительный эффект и носит симптоматический характер. Хирургические способы лечения ЭЭД, такие как передняя послойная кератопластика, аутоконъюнктивальная пластика, подшивание амниотической оболочки носят паллиативный характер и не являются патогенетически обоснованными. Стандартом лечения ЭЭД до настоящего времени является сквозная кератопластика. Однако наличие швов и риск развития осложнений в интра- и послеоперационном периоде обусловливают поиск и разработку новых, более эффективных способов лечения заболевания. В связи с вышеизложенным особый интерес представляют клеточные технологии с применением цитокинов. Цитокины представляют собой единую самостоятельную систему регуляции функций организма, обеспечивающую развитие защитных реакций и поддержание гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. Основным источником данных биологически активных веществ являются мононуклеары крови, изначально обладающие высоким секреторным потенциалом и способностью адаптироваться к любому микроокружению.

    Цель. В эксперименте изучить патоморфологические особенности репаративной регенерации при ЭЭД роговицы на фоне пневмодесцеметоабляции с последующим интрастромальным введением аутологичных мононуклеарных клеток.

    Материал и методы

    Выполнена серия экспериментов на 24 кроликах породы Шиншилла массой 2,5-4,0 кг. На I этапе животным в условиях операционной под наркозом моделировали ЭЭД путем механического повреждения и удаления эндотелия роговицы одного из глаз. На II этапе через две недели после развития патологического процесса в роговой оболочке животные в зависимости от планируемого лечения были разделены на 2 группы: основная – 12 кроликов (24 глаза), которым выполняли пневмодесцеметоабляцию и введение в строму аутологичных мононуклеаров крови. Непосредственно перед началом эксперимента производили забор крови у животных и выделение аутологичных мононуклеаров методом фракционирования на градиенте плотности. В условиях операционной под наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики каждому животному в роговице с предварительно индуцированной ЭЭД прелимбально сверху на уровне задней трети вводили иглу калибра 25 G и аккуратно продвигали в ее парацентральные отделы. На границе между задними отделами стромы и десцеметовой оболочкой вводили стерильный воздух, индуцируя пневмодесцеметоабляцию, после чего в зону отслойки десцеметовой оболочки вводили суспензию аутологичных мононуклеаров крови в объеме 0,3-0,5 мл. Затем иглу извлекали. Группа сравнения – 12 кроликов (24 глаза), которым проводили традиционное консервативное лечение (метаболические средства, кератопротекторы, кортикостероиды).

    Общая продолжительность эксперимента составила 35 суток. В ходе эксперимента проводили наружный осмотр, фоторегистрацию. Забор материала осуществляли на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки от начала эксперимента. Выведение животных их эксперимента осуществляли с соблюдением правил и норм, прописанных в директивах Европейского сообщества (86/609 ЕЕС) и Хельсинской декларации. Полученный материал фиксировали для световой микроскопии, окрашивали гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизона.

    Цифровой материал обработан общепринятыми методами вариационной статистики с расчетом среднего арифметического значения М и ошибки среднего m. Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.

    Результаты

    В ходе морфологических исследований получены следующие данные.

    Через две недели после индуцирования ЭЭД у животных обеих групп в роговице обнаруживались характерные для данного патологичного процесса изменения: передний эпителий с выраженными признаками баллонной дистрофии. Количество дистрофически измененных эпителиоцитов составляло 20±1,5 клеток в поле зрения. Толщина переднего эпителия находилась в пределах 35,7±0,7 мкм. Собственное вещество роговицы представлено гидратированными коллагеновыми волокнами, между которыми обнаруживались тканевые щели общей площадью до 1190±114 мкм2. Задняя пограничная мембрана была неравномерно утолщена, эндотелий отсутствовал на всем протяжении.

    На 3-и сутки после проведенного лечения у животных основной группы среди клеток переднего эпителия обнаруживались эпителиоциты с явлениями балонной дистрофии. Собственное вещество роговицы было представлено рыхло расположенными коллагеновыми волокнами, при этом общая площадь тканевых щелей составляла 620±84 мкм2. В центральных отделах определялись локальная зона пневмодесцеметоабляции и диффузная мононуклеарная инфильтрация. Эндотелий отсутствовал.

    У животных группы сравнения эпителий роговицы был представлен дистрофически измененными эпителиоцитами. Передняя пограничная мембрана визуализировалась не на всем протяжении. Подлежащая строма роговицы характеризовалась выраженным отеком, коллагеновые волокна в ней располагались в виде рыхлой сети. Эндотелий роговицы на большем протяжении был десквамирован.

    На 7-е сутки у животных основной группы передний эпителий имел нормальное строение. В собственном веществе роговицы ход коллагеновых волокон становился более упорядоченным. Площадь полостей между волокнами сократилась до 492±63 мкм2. Зона пневмодесцеметоабляции в центральных отделах роговой оболочки уменьшилась, в строме сохранялась мононуклеарная инфильтрация. Со стороны эндотелия обнаруживались клетки отростчатой формы. У животных группы сравнения клетки переднего эпителия были дистрофически изменены. Толщина эпителия составляла 34,4±0,8 мкм. Коллагеновые волокна собственного вещества роговицы с явлениями отека. Площадь тканевых щелей составляла 972±81 мкм2. Эндотелий отсутствовал.

    На 14-е сутки у животных основной группы передний эпителий был представлен 4-5 слоями плоских клеток. Коллагеновые волокна основного вещества в задней трети стромы были раздвинуты отечной жидкостью. Площадь тканевых щелей составляла 202±44 мкм2. В центральных отделах роговицы зона пневмодесцеметоабляции практически отсутствовала. Мононуклеарная инфильтрация собственного вещества была менее выраженной. Эндотелий был представлен слоем отростчатых клеток. В группе сравнения в переднем эпителии обнаруживались дистрофически измененные эпителиоциты. Толщина переднего эпителия составляла 32±0,9 мкм. В собственном веществе сохранялись неравномерно выраженные явления отека. Площадь тканевых щелей – 725±93 мкм2. Местами обнаруживались новообразованные сосуды. Эндотелий представлял собой неравномерный, местами слущивающийся слой дистрофически измененных клеток.

    На 21-е сутки у животных основной группы передний эпителий имел нормальное строение. Передняя пограничная мембрана дифференцировалась на всем протяжении. Собственное вещество роговой оболочки содержало компактно расположенные коллагеновые волокна. Задняя пограничная мембрана хорошо визуализировалась на всем протяжении и была гомогенна. Эндотелий представлял собой слой отростчатых клеток. У животных группы сравнения в переднем эпителии обнаруживалось небольшое количество клеток с признаками баллонной дистрофии. Площадь тканевых щелей в строме роговицы составляла 585±69 мкм2, что свидетельствовало об уменьшении степени гидратации. Однако число новообразованных сосудов увеличилось. Эндотелий был представлен слоем дистрофически измененных клеток.

    Цитокины представляют сложную сеть иммуномедиаторов (порядка двухсот), которые регулируют и определяют природу иммунного ответа [1, 2, 4]. В норме цитокины вырабатываются редко и временно, являясь медиаторами иммунного ответа, пролиферации и регенерации. Продуцентами цитокинов, как правило, являются клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Стимуляция их продукции происходит в ответ на повреждение ткани, при этом цитокины действуют по каскадному принципу [1, 2, 3, 5, 6, 7, 8].

    При интрастромальном введении аутологичных мононуклеаров крови в зону десцеметоабляции при ЭЭД роговицы создается локально высокая концентрация клеток данной популяции в патологическом очаге, что обеспечивает направленное воздействие на течение патологического процесса.

    В связи с этим можно предположить, что дополнительное экзогенное поступление в патологический очаг мононуклеарных клеток индуцирует пролиферативную активность эндотелия роговицы и способствует регенерации поврежденных роговичных структур.

    Заключение

    В эксперименте in vivo установлено, что интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров в зону десцеметоабляции при ЭЭД стимулирует регенерацию поврежденных структур роговичной ткани, благодаря чему уменьшается ее отек и восстанавливается прозрачность.