Рис. 1. График изменения оценки степени гиперемии конъюнктивы у животных исследуемых групп Fig. 1. Graph representing dynamics of conjunctival hyperemia grade at animals of study groups
Рис. 2. График изменения оценки степени повреждения роговичного эпителия по Эфрону у животных исследуемых групп Fig. 2. Graph representing dynamics of corneal epithelium damage grade according to Efron scale at animals of study groups
При этом клинически наблюдают симптомокомплекс, характерный для синдрома «сухого глаза» или токсико-аллергического конъюнктивита [1–6].
Ухудшение состояния глазной поверхности у пациентов, страдающих глаукомой, может быть связано как непосредственно с заболеванием, так и с влиянием действующих веществ гипотензивных препаратов либо консервантов, входящих в состав капель [1, 3]. Так, применение аналогов простагландинов связывают с увеличением частоты развития дисфункции мейбомиевых желез в сравнении с другими гипотензивными препаратами [7]. Применение консервантсодержащих препаратов ассоциировано с повышением уровней провоспалительных цитокинов во влаге передней камеры и в слезной пленке (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-15, ИЛ-17, TNF-α) [8–14]. Бесконсервантная терапия глаукомы в гораздо меньшей степени влияет на состояние тканей глазной поверхности, однако ее доступность для пациентов на сегодняшний день остается достаточно низкой [2–4, 14, 15].
Доказано, что длительная местная терапия глаукомы, предшествующая хирургическому лечению, ухудшает исходы операции [8, 16–18]. Согласно исследованию C. Boimer и соавт., успех гипотензивных вмешательств зависел от количества используемых консервант содержащих препаратов и от дозы бензалкония хлорида, получаемой пациентом в день. Каждая дополнительная капля препарата, содержащего бензалкония хлорид, увеличивала риск неудачи операции на 21% [19]. По данным разных исследователей, ухудшение результатов хирургии глаукомы на фоне гипотензивной терапии было связано с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов внутриглазной жидкости (TGF-2, ИЛ-6, TNF-α, VEGF) [8, 16–18], а также со сниженным содержанием металлопротеиназ, способствующих деградации экстрацеллюлярного матрикса, в строме и эпителии конъюнктивы (ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-9) [20].
Поскольку проблема послеоперационного рубцевания в хирургии глаукомы остается нерешенной на данный момент, многие исследования способов его коррекции проводят in vivo. При этом в качестве экспериментальных животных чаще всего используются кролики.
В условиях, когда большинство пациентов подвергаются хирургии глаукомы на фоне длительной гипотензивной медикаментозной терапии, ухудшающей ее исходы, исследование различных методов профилактики послеоперационного рубцевания целесообразно проводить на глазах животных с состоянием тканей глазной поверхности, соответствующим таковому у оперируемых пациентов. Поэтому актуальным является исследование способов моделирования данного состояния тканей конъюнктивы и теноновой капсулы у лабораторных животных, а также изучение патологических процессов, лежащих в основе наблюдаемых под действием консервантсодержащих гипотензивных препаратов изменений для разработки патофизиологически обоснованных методов коррекции заживления операционной раны и последующего улучшения исходов хирургии глаукомы.
Цель
Исследование экспериментальной модели хронического воспаления тканей глазной поверхности, ассоциированного с медикаментозным лечением глаукомы.
Материал и методы
Исследование было выполнено на базе кафедры офтальмологии, биотехнологического центра «БиоТех» и Института экспериментальной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России в соответствии с современными требованиями гуманного обращения с экспериментальными животными.
Эксперимент проведен на 52 кроликах породы шиншилла (на правых глазах каждого животного): 40 кроликов ежедневно получали конъюнктивальные инстилляции гипотензивного препарата, содержащего комбинацию аналога простагландина (АПГ) и бета-блокатора (ББ), а также бензалкония хлорид 0,01% в качестве консерванта (группа АПГ + ББ). 12 кроликам контрольной группы ежедневно выполняли инстилляции физиологического раствора в исследуемый глаз.
В течение 3 месяцев кроликам проводили регулярное офтальмологическое обследование, включавшее в себя биомикроскопию с определением степени конъюнктивальной гиперемии в баллах от 0 до 3, проведение теста Ширмера I, а также определение степени повреждения роговичного эпителия при исследовании в синем свете с флуоресцеином в баллах от 0 до 4 по шкале Эфрона. По истечении срока наблюдения по 4 животных в каждой группе выводили из эксперимента для морфологического изучения тканей конъюнктивы, теноновой капсулы и роговицы. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, а также альциановым синим с гематоксилином для визуализации бокаловидных клеток.
Статистический анализ данных производили с помощью программного обеспечения Statistica 12.0 (StatSoft, США). Нормальность распределения проверяли с помощью критериев Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. В связи с распределением, отличным от нормального, в дальнейшем были применены непараметрические методы статистического анализа.
Рис. 3. График изменения результатов пробы Ширмера I у животных исследуемых групп Fig. 3. Graph representing dynamics of Shirmers’s test I results at animals of study groups
Рис. 4. Конъюнктива кроликов исследуемых групп. Окраска: гематоксилин, эозин. А. Группа АПГ + ББ. Увеличение ×100, ×400. Конъюнктива и ее эпителий утолщены, архитектоника эпителия нарушена. Участки фиброза, неоангиогенеза, инфильтрации моноцитами. Б. Группа контроля Fig. 4. Rabbits' conjunctival tissue. Stain: hematoxylin, eosin. A. PGA + BB group. Magnification: ×100, ×400. Conjunctiva and its epithelium are thickened. Epithelium structure is impared. Lesions of fibrosis, neoangiogenesis, monocytes infiltration. Б. Control group. Magnification: ×400
Результаты и обсуждение
В ходе офтальмологического наблюдения за животными выявлено постепенное увеличение степени конъюнктивальной гиперемии у кроликов, получавших комбинированный консервантсодержащий препарат с АПГ и ББ. Достоверные различия в сравнении с исходной оценкой были обнаружены уже через 2 недели после начала эксперимента, когда у половины животных степень гиперемии была оценена как легкая, а в 12,5% случаев – как средняя. Через 1 месяц лишь у 5 животных из 40 не наблюдали гиперемии конъюнктивы. В то же время в контрольной группе не наблюдали достоверно выраженных изменений данного показателя, и к концу периода наблюдения лишь на 3 глазах была легкая гиперемия (рис. 1).
При биомикроскопии в синем свете с флуоресцеином выявляли точечные дефекты эпителия роговицы у 32,5% кроликов группы АПГ + ББ уже через 2 недели после начала эксперимента. Через 1 месяц степень повреждения эпителия оценивали в 1 или 2 балла у 55% животных. К концу периода наблюдения у 87,5% кроликов наблюдали повреждения роговичного эпителия от точечных до сливных очагов. В группе контроля ни у одного животного не было выявлено окрашивания эпителия роговицы флуоресцеином за весь период наблюдения (рис. 2).
Применение АПГ + ББ сопровождалось достоверным снижением слезопродукции согласно результатам пробы Ширмера I. Исходные значения пробы были сопоставимы в обеих группах и варьировали в пределах 12–16 мм. Через 1 месяц после начала эксперимента у животных, которые получали комбинированный препарат, наблюдали снижение слезопродукции до 12,0 (12,0; 13,0) мм, а через 3 месяца – до 10,0 (9,5; 11,0) мм. В то же время в контрольной группе значения данного показателя не подверглись значительным изменениям и составили 15,0 (14,0; 15,0) мм, причем как через 1 месяц, так и через 3 месяца (рис. 3).
Результаты, полученные при офтальмологическом обследовании животных, соответствовали данным литературы, согласно которым применение консервантсодержащих гипотензивных препаратов способствует возникновению комплекса симптомов, сходных с синдромом «сухого глаза». При этом для пациентов, находящихся на длительной медикаментозной гипотензивной терапии консервантсодержащими препаратами, характерны конъюнктивальная гиперемия, особенно в случае применения АПГ, эпителиопатия с точечным окрашиванием роговицы, снижение слезопродукции и уменьшение времени разрыва слезной пленки [1–6].
Морфологическое исследование тканей глазной поверхности выявило изменения, свидетельствующие о развитии хронического воспаления в конъюнктиве и теноновой капсуле у животных, подвергшихся инстилляциям АПГ + ББ. На глазах данной группы было выявлено утолщение конъюнктивального эпителия. При этом архитектоника его слоев была нарушена в сравнении с препаратами контрольной группы. Собственная пластинка конъюнктивы кроликов данной группы также была утолщена, инфильтрирована мононуклеарами, содержала участки фиброза и неоангиогенеза (рис. 4А).
У кроликов группы контроля конъюнктива сохраняла нормальное строение (рис. 4Б). Также у кроликов группы АПГ + ББ наблюдали увеличение плотности бокаловидных клеток (рис. 5) и повреждение эпителия роговицы. На гистологических препаратах выявляли участки его расслоения и слущивания (рис. 6А). У кроликов контрольной группы послойное строение роговицы нарушено не было (рис. 6Б).
Согласно результатам гистологического исследования, как и в ранее опубликованных работах, были выявлены утолщение конъюнктивы и конъюнктивального эпителия, инфильтрация конъюнктивы и теноновой капсулы моноцитами, неоангиогенез и участки фиброза в собственном веществе конъюнктивы. Также полностью соответствовали данным литературы выявленные участки повреждения роговичного эпителия [21–27].
В нашем исследовании было также выявлено увеличение плотности бокаловидных клеток в эпителии конъюнктивы, связанное, вероятно, с применением латанопроста в составе комбинированного препарата, поскольку, согласно ранее опубликованным данным, применение бензалкония хлорида и ББ было ассоциировано со снижением плотности данных клеток [21, 26, 27].
Рис. 5. Бокаловидные клетки конъюнктивы (окрашены синим). Окраска: альциановый синий, гематоксилин. А. Группа АПГ + ББ. Увеличение: ×400, ×1000 (иммерсия). Б. Группа контроля. Увеличение: ×400 Fig. 5. Conjunctival goblet cells (blue color). Stain: Alcian blue, hematoxylin. A. PGA + BB group. Magnification: ×400, ×1000. Б. Control group. Magnification: ×400
Рис. 6. Роговица исследуемых групп. Окраска: гематоксилин, эозин. Увеличение ×400. A. Группа АПГ+ББ. Повреждение роговичного эпителия. Б. Группа контроля Fig. 6. Rabbits cornea. Stain: hematoxylin, eosin. Magnification: ×400. A. PGA+BB group. Damage of corneal epithelium. Б. Control group
Среди выявленных морфологических изменений конъюнктивы и теноновой капсулы субстратом для последующего ухудшения исходов операции по поводу глаукомы может быть повышенная инфильтрация мононуклеарами, неоангиогенез и участки фиброза, которые связывают с повышенной провоспалительной и профибротической готовностью конъюнктивы и теноновой капсулы.
Заключение
В результате ежедневных инстилляций консервантсодержащей фиксированной комбинации аналога простагландина и бета-блокатора в течение 3 месяцев на глазах кроликов была получена экспериментальная модель состояния тканей глазной поверхности, ассоциированного с медикаментозным лечением глаукомы.
Данное состояние сопровождалось морфологическими признаками хронического воспаления конъюнктивы и теноновой капсулы с клиническими проявлениями синдрома «сухого глаза».
Информация об авторах
Виктория Николаевна Германова – аспирант кафедры офтальмологии, врач-офтальмолог офтальмологического отделения № 3 (микрохирургического глаукомного), https:/orcid.org/0000-0002-0497-9813
Елена Владимировна Карлова – д.м.н., доцент кафедры офтальмологии, заместитель главного врача по инновационно-технологическому развитию, https:/orcid.org/0000-0003-4929-8832
Ирина Феликсовна Нефедова – зав. лабораторией экспериментальной морфологии Института экспериментальной медицины и биотехнологий, https:/orcid.org/0000-0002-7453-3120
Мария Владимировна Радайкина – зав. офтальмологическим отделением № 3 (микрохирургическим глаукомным), https:/orcid.org/0000-0002-3644-6296
Information about the authors
Viktoriya N. Germanova – postgraduate student of the Department of Ophthalmology, ophthalmologist of Ophthalmological Department No. 3 (Glaucoma Microsurgery), https:/orcid.org/0000-0002-0497-9813
Elena V. Karlova – Doct. of Sci. (Med.), Associate Professor of the Department of Ophthalmology, Deputy Head Doctor for Iinnovative Technological Development, https:/orcid.org/0000-0003-4929-8832
Irina F. Nefedova – Head of the Laboratory of Experimental Morphology of the Institute of Experimental Medicine & Biotechnology, https:/orcid.org/0000-0002-7453-3120
Mariya V. Radaikina – Head of Ophthalmological Department No. 3 (Glaucoma Microsurgery), https:/orcid.org/0000-0002-3644-6296.
Вклад авторов в работу:
В.Н. Германова: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Е.В. Карлова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
И.Ф. Нефедова: анализ и обработка материала, написание, редактирование.
М.В. Радайкина: сбор, анализ и обработка материала, написание, редактирование.
Authors' contribution:
V.N. Germanova: collection, analysis and processing of material, statistical processing of data, writing, editing, final approval of the version to be published.
E.V. Karlova: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.
I.F. Nefedova: analysis and processing of material, writing, editing.
M.V. Radaikina: collection, analysis and processing of material, writing, editing.
Финансирование: Научно-исследовательская работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Самарской области, Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.
Конфликт интересов: Отсутствует.
Financial Disclosure: This research is supported by the Ministry of Health and Science of the Samara Region, the Foundation for the Assistance to Small Innovative Enterprises in Science and Technology.
Conflict of interest: None.
Поступила: 01.03.2022
Переработана: 24.03.2022
Принята к печати: 01.04.2022
Originally received: 01.03.2022
Final revision: 24.03.2022
Accepted: 01.04.2022
