Экспериментальное исследование биодеградации синтетических полимерных матриц как перспективных подложек для лимбальных стволовых клеток

    Актуальность

    Гибель или дисфункция лимбальных стволовых клеток (ЛСК) является одной из основных причин сосудистых помутнений роговицы, клинически проявляющихся состоянием, получившим название лимбальной недостаточности (ЛН) [1, 7]. В настоящее время изучается возможность трансплантации на роговицу культивируемых in vitro ЛСК как один из способов устранения ЛН [6].

    По данным литературы, амниотическая мембрана (АМ) является наиболее распространенным носителем для культивирования ЛСК [6, 8], однако дефицит материала, наличие определенных трудностей при заготовке, консервировании и использовании АМ для вышеуказанных целей обусловливают поиск новых видов носителей, изготавливаемых в том числе из синтетических материалов [2].

    Оптимальными свойствами матриц-носителей для ЛСК являются прозрачность (возможность оценки адгезии и жизнеспособности клеток на поверхности матрицы под микроскопом, а также возможность наблюдения за глазной поверхностью после трансплантации матрицы); прочность (достаточная для подшивания матрицы к глазной поверхности); эластичность и низкая упругость (для равномерного распределения матрицы на глазной поверхности без формирования складок); способность к биодеградации в пределах 3–4 нед [3].

    Такими свойствами, необходимыми для трансплантации на роговицу культивированных клеток, обладает АМ. По данным литературы, могут быть пригодны и матрицы на основе полилактид-гликолида [4, 5], полилактид-капролактона и поли-ε-капролактона [9, 11].

    Цель

    Изучить сроки биодеградации синтетических полиэфирных матриц из поли(лактид-гликолида) (ПЛГ), поли(лактид-капролактона) (ПЛК) и поли-ε-капролактона (ПКЛ) на глазных поверхностях лабораторных животных.

    Материал и методы

    Для приготовления матриц использовали поли-L-лактид-гликолид (85/15) (ПЛГ) (h = 3,13 дл/г, Purac), поли-L-лактид-капролактон (85/15) (ПЛК) (h = 1,66 дл/г, Purac) и поли(ε-капролактон) (ПКЛ) (Mn 80000, Sigma). Материалы ПЛГ и ПЛК имели степень чистоты Medical Grade. Все полимеры растворяли в трихлорметане (Реактив, Россия) до конечной концентрации в 2 мг/мл и наносили их на предметные стекла.

    После испарения растворителя на воздухе изготовленные матрицы сушили при температуре 37 °С до полного удаления растворителя (рис. 1). Толщина образцов каждой из исследуемых синтетических матриц составляла 5; 10 и 15 мкм.

    Исследование сроков биодеградации (в днях) матриц из синтетических полимеров выполняли на 12 кроликах (36 глаз). В зависимости от исследуемого материала были сформированы три группы: с использованием матриц из ПЛГ (группа I), матриц из ПЛК (группа II) и матриц из ПКЛ (группа III). В зависимости от толщины материала каждую группу разделили на три подгруппы: 5 мкм – подгруппа «А», 10 мкм – «Б», 15 мкм – «В».

    Изготовленные стерильные образцы матриц круглой формы диаметром 20 мм в условиях учебной операционной клиники офтальмологии ВМедА под микроскопом укладывали на поверхность роговицы с захватом на 1–2 мм перилимбальной конъюнктивы, к которой фиксировали матрицу по краям 8 узловыми швами нейлоновой нитью 10/0 фирмы Alcon (США) (рис. 2 а, б).

    В послеоперационном периоде проводили консервативное лечение в объеме: инстилляции декса-гентамицина 3 раза в день (до 21 сут). Сроки наблюдения составили 3; 10; 21; 30 сут. Выполнялась биомикроскопия глаз в каждой группе исследования на щелевой лампе Haag-Streit BD900 (Швейцария) с фотографированием. Оценивался процесс биодеградации матриц в динамике (истончение матриц в области наложения швов, появление участков деструкции) и сроки их полной деградации.

    Под полной биодеградацией подразумевали отсутствие матриц на глазной поверхности либо наличие остатков матриц в местах наложения швов с их отсутствием на поверхности роговицы.

    Результаты

    В результате наблюдения процессов биодеградации в I группе на 3-и сутки ни в одном случае признаков деградации материала выявлено не было. Отмечали равномерное покрытие глазной поверхности во всех подгруппах. На 10-е сутки наблюдения отмечали истончение краев матриц в области наложения швов только в подгруппе «А». Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было.

    На 21-е сутки на матрицах в подгруппе «А» наблюдали появление отдельных участков деструкции материала. В подгруппе «Б» имелись дефекты материала в области швов. В подгруппе «В» изменений целостности материала не было. На 30-е сутки в 66% случаев отмечали полную деградацию матриц в подгруппе «А» (рис. 3 а). На матрицах в подгруппе «Б» наблюдали появление отдельных единичных участков деградации матриц. Матрицы в подгруппе «В» претерпевали лишь начальные изменения целостности в области наложения швов.

    В результате наблюдения биодеградации матриц во II группе на 3-и сутки отмечали появление первых признаков деградации лишь образцов в подгруппе «А». Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было. На 10-е сутки на матрицах в подгруппе «А» отмечали появление участков краевой деструкции, на образцах в подгруппе «Б» наблюдали начальные признаки деградации материала в области швов. Признаков деградации матриц в подгруппе «В» не было. На 21-е сутки наблюдалась выраженная деструкция матриц в подгруппе «А». На матрицах в подгруппе «Б» отмечали появление областей деструкции и постепенного «подворачивания» по периферии. На образцах в подгруппе «В» имелись признаки начальной деградации в области наложения швов. На 30-е сутки в подгруппе «А» в 100% случаев матрицы полностью деградировали (рис. 3 б). Образцы матриц в подгруппе «Б» продолжали деградировать с «подворачиванием» их краев по периферии. Образцы в подгруппе «В» имели изменения в виде островковых областей деструкции.

    В результате наблюдения процессов биодеградации в III группе на 3-и, 10-е и 21-е сутки ни в одном случае признаков деградации материала выявлено не было.

    Отмечали равномерное покрытие глазной поверхности во всех подгруппах. На 30-е сутки наблюдения отмечали истончение краев матриц в области наложения швов только в подгруппе «А» (рис. 3 в). Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было.

    Обсуждение

    При сравнении сроков биодеградации было выявлено, что матрицы из ПЛК (5 мкм) начинали заметно деградировать уже на 10-е сутки, тогда как на образцах матриц из ПЛГ (5 мкм) достоверные признаки деградации наблюдались значительно позже (на 21-е сутки). Первые признаки деградации матриц из ПКЛ наблюдались лишь на 30-е сутки лишь в подгруппе с толщиной образцов 5 мкм. Полная биодеградация матриц из ПЛК с толщиной 5 мкм занимала не более 30 сут. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что скорость биодеградации матриц из ПЛК толщиной 5 мкм протекала быстрее, чем из ПЛГ этой же толщины, и по своим срокам сопоставима со сроками лизирования амниотической мембраны на поверхности роговицы [3]. Таким образом, наиболее благоприятное для трансплантации стволовых клеток роговицы сочетание изучаемых свойств оказалось у матриц из ПЛК.

    Заключение

    1. По срокам биодеградации наиболее подходящая модель носителя для культивирования и трансплантации стволовых клеток роговицы – матрица из поли(лактид-капролактона) (85/15) толщиной 5 мкм.

    2. Полученные результаты исследования сроков биодеградации свидетельствуют о необходимости дальнейшего экспериментального исследования синтетических матриц как носителей для культивированных лимбальных стволовых клеток с целью устранения лимбальной недостаточности.