Экспериментальное исследование влияния сульфатированных гликозаминогликанов на культуру клеток пигментного эпителия сетчатки человека при воздействии ультразвука (предварительные результаты)

    Актуальность Согласно современным представлениям, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) играет основную роль в поддержании нормальной жизнедеятельности фоторецепторов сетчатки, выполняя, в частности, транспортную, метаболическую и барьерную функции [2]. На сегодняшний день доказана роль хронического воспаления и оксидативного стресса в патогенезе повреждения ПЭС при возрастной макулярной дегенерации, приводящей к снижению центральной остроты зрения и снижению качества жизни пацинтов [1]. В связи развитием и совершенствованием витреоретинальной и катарактальной хирургии актуальной становится проблема минимизации интраоперационного воздействия на структуры глаза. Несмотря на тенденцию к снижению использования энергии ультразвука при экстракции катаракты и применение различных приемов протекции структур переднего отрезка глаза, недостаточное внимание уделяется защите заднего отрезка глаза. В ходе витреоретинального вмешательства хирург применяет мануальную технику для удаление мембран, шварт, внутренней пограничной мембраны с использованием эндовитреальных пинцетов, скраберов. При этом происходит неизбежная травматизация тканей за счет прямого механического и опосредованного фототоксического воздействия, что приводит к острому оксидативному стрессу структур сетчатки, высвобождению большого количества медиаторов воспаления, которые в ряде случаев не могут быть подавлены за счет физиологических противовоспалительных механизмов. Согласно литературным данным, макулярный отек, связанный с тракционной макулярной патологией, сохраняется после витректомии в 64% случаев, даже при полном устранении тракционного компонента, что снижает эффективность вмешательства и конечную остроту зрения пациента, несмотря на анатомический успех оперативного лечения [11].

    В связи с этим представляет интерес разработка фармакологических препаратов, позволяющих снизить повреждающий эффект хирургического вмешательства, оказывая защитное действие на структуры сетчатки. Перспективным классом фармакологических соединений для применения в офтальмологии являются сульфатированные гликозаминогликаны.

    Сульфатированный гликозаминогликаны (сГАГ) представляют собой линейные гетерополисахариды, состоящие из повторяющихся дисахаридных фрагментов, один из которых является аминосахаридом, другой уроновой кислотой. К сГАГ относятся хондроитин 4,6 сульфаты (ХС), кератансульфаты (КС), дерматансульфаты, гепарин, гепарансульфат. В тканях организма сГАГ встречаются в составе протеогликанов, определяя их функции в системе межклеточного матрикса, гликокаликса, клеточных мембран, секреторных гранул, а также в ядрах клеток в виде комплекса с хроматином [12].

    Биологические свойства сГАГ определяются их полианионным химическим строением, дающим возможностях связывать токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем самым их поступление в клетки [4,6]. СГАГ способны подавлять действие клеточных ферментов, связываясь с их активными центрами и изменяя их конформацию[12,5,8].

    При повреждении ткани происходит нарушение структуры протеогликанов и высвобождение большого количества свободных сГАГ, которые оказывают ингибирующее влияние на ранние этапы воспаления за счет связывания положительно заряженных фрагментов поврежденных клеточных мембран, медиаторов, антигенных детерминант. Также сГАГ тормозят действие свободных радикалов за счет стабилизации активности восстанавливающих НАДФ дегидрогеназ и обмена ДНК [3].

    За счет способности сГАГ образовывать на поверхности клеток защитный слой, принцип действия которого сходен с естественным функционированием гликокаликса, они находят широкое применение для протекции тканей глаза в офтальмохирургии в виде вископротекторов[10] и в качестве компонента раствора для повышения жизнеспособности и стабилизации плотности эндотелиальных клеток донорского материала при различных методах консервации [9].

    Цель Получение новых данных и оценка влияния композиции, содержащей сульфатированные гликозаминогликаны различной концентрации на культуру клеток пигментного эпителия человека при экспериментальном повреждающем воздействии с использованием энергии ультразвука.

    Материал иметоды В данном исследовании использован комплекс хондроитинсульфатов с кератансульфатом, разработанный ООО «НЭП «Микрохирургия глаза». Оригинальная субстанция выделялась из прозрачной (неизмененной) стромы роговиц сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот)по оригинальной технологии, описанной во временной фармакопейной статье 422678-96. Материалом для исследования послужили клетки пигментного эпителия сетчатки человека. Данный тип клеток является удобной моделью для проведения исследования, так как для них возможно прижизненное наблюдение с помощью микроскопа [7]. Клетки были выделены из эксплантационных культур сетчатки человека (постмортальный материал) путем высева, после чего при достижении ими конфлюэнтности 95% на 0 пассаже были использованы для проведения эксперимента. Клетки культивировали на питательной коммерческой среде StemPro® NSC SFM - Serum-Free Human Neural Stem Cell Culture Medium (производитель Gibco) в условиях стандартного клеточного CO2 инкубатора Binder C 150(Германия) при стандартных условиях культивирования (37°С, влажность 96%). С целью предварительной оценки воздействия ультразвука, клетки пигментного эпителия в среде пассировали на одну 96-луночную планшетку с плотностью 2000 клеток на лунку. При этом клетки поделили на 5 равных групп.

    В культуру клеток группы №1 добавляли композицию сГАГ с концентрацией действующего вещества 0,1%. В культуру клеток группы №2 сГАГ с концентрацией действующего вещества 1%, в культуру клеток группы №3 сГАГ с концентрацией действующего вещества 3% . В качестве групп контроля использовали 2 группы клеток без предварительного добавления раствора сГАГ(группа №4 и №5). После этого клетки групп №1, №2, №3, №4 подвергали воздействия ультразвуковой энергии с применением стандартного наконечника факоэмульсификатора INFINITI® Vision System(Alcon) с показателями ирригации 60 мл/мин,ультразвука 50% непосредственно в лунки в течение 2 секунд. Группу №5 оставляли без воздействия ультразвука. Оценку состояния клеток проводили через 24 часа после обработки с помощью инвертированного микроскопа с фазовым контрастом при десятикратном увеличении с подсчетом живых клеток в поле зрения. При этом всего проводили подсчет в 3 полях зрения для каждой группы, оценивали морфологию клеток с последующим подсчетом нежизнеспособных клеток. Подсчет клеток производился рутинным методом с помощью цифровой фотографии и персонального компьютера, в результате было выведено процентное соотношение жизнеспособных и погибших клеток в каждой группе.

    Результаты и обсуждение Количественный анализ жизнеспособности клеток через 24 часа после воздействия ультразвуковой энергии показал, что

    в группе №1(0,1%сГАГ) процент сохранных клеток составил 64%,в 36% клетах выявлены признаки нежизнеспособности. В группе №2 (1%сГАГ) жизнеспособность сохраняли 57% клеток, в группе №3 (3% сГАГ)- 51% клеток В группе контроля без применения сГАГ и изолированным воздействием ультразвука(группа №4) 36% клеток были жизнеспособны, 64% клеток были нежизнеспособны. В группе контроля без применения сГАГ и без воздействия ультразвуковой энергии(группа №5) жизнеспособными оставались 99,1% клеток, 0,9% клеток были нежизнеспособны.

    С точки зрения общебиологического действия, ведущим фактором, обуславливающим изменения в тканях глаза при воздействии ультразвука является кавитация. Кавитация представляет собой образование и схлопывание пузырьков из растворенных в жидкости газов. Данный процесс вызывает гидродинамическую (ударными микропотоками) и звукохимическую травму (нарушение клеточных структур в результате усиления свободнорадикального окисления липидов). Кавитация сопровождается разрывом молекулярных связей воды на свободные радикалы ОН и Н, что является первопричиной окисляющего действия ультразвука. Таким образом, воздействие ультразвука можно использовать в качестве модели механического и свободнорадикального повреждения структур сетчатки [13].

     При микроскопии методом фазового контраста до воздействия ультразвуком (рис. 1) отмечалось, что клетки пигментного эпителия имели полигональную форму, цитоплазму с отростками, содержали овальные ядра с ровными контурами, умеренно конденсированным хроматином. Гранулы пигмента были сконцентрированы вокруг ядра. Межклеточные контакты по типу десмосом были хорошо сформированы. В цитоплазме клеток определялось большое число меланосом.

    В группе контроля (группа № 4) с изолированным воздействием ультразвука без добавления сГАГ (рис. 2)наблюдались обширные участки клеточного повреждения. При этом отмечалось «запустевание» цитоплазмы клеток и их отростков, уменьшение количества органелл и меланосом, конденсация хроматина в форме «подковы». Межклеточные контакты не были выражены. В части препаратов выявляли только отдельные гранулы меланина. Гранулы пигмента в поврежденных клетках были расположены по периферии около цитоплазматической мембраны и отростков. Данные изменения позволяют судить о массивном повреждении клеток под действием ультразвука.

    При фазово-контрастной микроскопии клеток группы № 1, № 2, № 3 (рис. 3, 4, 5 соответственно) через 24 часа после воздействия также наблюдались признаки клеточного повреждения, в том числе расщепление слоев цитоскелета, сморщивание клеток, конденсация хроматина в форме подковы и формирование вакуолей с органеллами, однако число поврежденных клеток в группах с применением сГАГ было меньше, чем в контрольной группе с изолированным воздействием ультразвука. Наибольшая сохранность неизмененных клеток наблюдалась в присутствии образцов сГАГ с концентрацией активного вещества 0,1%.

    Полученные результаты подтверждают выраженное мембраностабилизирующее и антиоксидантное действие сГАГ на пигментный эпителий сетчатки. Экспериментальные показатели согласуются с известным из литературы предположением о механизмах клеточной защиты, при котором гетерополисахаридные компоненты межклеточного матрикса выступают в виде своеобразного щита от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов [3].

    Выводы Таким образом, в ходе проведения предварительного эксперимента по определению эффекта сульфатированных гликозаминогликанов различной концентрации на культуру клеток пигментного эпителия человека при повреждающем воздействии с использованием энергии ультразвука доказано наличие протективного и мембраностабилизирующего действия, результатом которого становится повышение жизнеспособности клеток. Однако требуются дальнейшие исследования для определения возможности применения данных веществ в витреоретинальной хирургии.