Экспериментальное изучение ферментативной устойчивости донорской роговицы, обработанной по методике УФ-кросслинкинга

     Одним из наиболее тяжелых осложнений заболеваний роговицы воспалительного, дистрофического или травматического генеза является формирование фистулы роговицы, которое угрожает развитием эндофтальмита, необратимым снижением зрения или гибелью глазного яблока.

    Кератопластика является радикальным способом лечения данной патологии [1, 3]. В некоторых случаях, в частности при нейротрофическом кератите, при синдроме «сухого глаза» после кератопластики, нередко отмечается замедление эпителизации, что может способствовать инфицированию трансплантата или приводить к его лизису под воздействием протеолитических ферментов слезы и рецидиву фистулы [2, 6, 8].

    Известно, что биохимические свойства роговицы в большей мере зависят от состояния волокон стромального коллагена, межколлагеновых связей и их структурной организации [4, 5, 7, 9]. Использование методов усиления межколлагеновых связей, утолщение волокон коллагена приводит к усилению биохимических свойств роговицы. Это, в свою очередь, позволяет трансплантату роговицы противостоять воздействию агрессивных факторов слезной жидкости и воспалительных клеток, при этом значительно снижается риск развития рецидива заболевания [4, 6, 9].

    Кросслинкинг роговичного коллагена является методом «склеивания» коллагеновых фибрилл, что способствует повышению биохимической стабильности роговицы. Стабилизирующий биохимический эффект кросслинкинга может быть объяснен изменением структуры коллагеновых фибрилл и блокированием специфических участков, взаимодействующих с ферментами.

    Из литературы известно, что под влиянием ультрафиолетового излучения и рибофлавина происходит усиление поперечных внутримолекулярных связей роговичного коллагена с образованием димеров из двух ?-цепей без деградации коллагеновых белков [4, 5].

    В зарубежной литературе описаны эксперименты, подтверждающие эффективность данного метода, в том числе с использованием химических воздействий на роговицу. Немецкие ученые Spoerl E., Wollensak G. также проводили экспериментальные исследования, которые подтвердили повышение устойчивости роговицы после комбинированного воздействия рибофлавина и ультрафиолетового излучения к действию ферментов [7, 9]. Описание подобных экспериментов в отечественной литературе нами не найдено.

     Особенностью этой работы стало исследование донорских роговиц, консервированных в среде Борзенка-Мороз и обработанных по методике кросслинкинга с добавлением протеолитических ферментов, разрушающих структуру коллагена роговицы, а именно коллагеназы in vitro, проведение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

    Цель

    Изучить устойчивость донорской роговицы, консервированной в среде Борзенка-Мороз и обработанной по методике кросслинкинга, к коллагеназе.

    Материал и методы

    Объектом исследования являлись донорские роговицы (n=24), которые были распределены по 4 экспе риментальным группам. Все роговицы консервировались в среде Борзенка-Мороз в течение 24 часов до начала эксперимента по стандартной методике (2). Первая группа содержала только консервированные в среде Борзенка-Мороз донорские роговицы (n=6). Во вторую группу входили консервированные донорские роговицы с добавлением рибофлавина, обработанные по методике кросслинкинга (n=6). Третья группа была сформирована из консервированных донорских роговиц, обработанных коллагеназой: результат оценивался в динамике через 24 часа (n=3) и через 72 часа (n=3). Четвертая группа состояла из консервированных донорских роговиц с добавлением рибофлавина, после кросслинкинга, обработанных коллагеназой: результат оценивался в динамике через 24 часа (n=3) и через 72 часа (n=3).

    Особенности подготовки препаратов к сканирующей электронной микроскопии заключались в том, что роговицы обрабатывались по методике кросслинкинга: к донорским роговицам, помещенным в среду Борзенка-Мороз, добавляли 1 мл 0,1%-ного раствора рибофлавина, инкубировали в течение 1 часа, после чего помещали в стерильную чашку Петри и обрабатывали ультрафиолетовым излучением с длиной волны 370 нм и мощностью 3 мВ/см2 в течение 30 минут.

    Для облучения использовали прибор UV-X s/n 1000-401-39 (Швейцария). В процессе облучения ультрафиолетом на донорскую роговицу каждые 5 минут инстиллировали по 1 капле 0,1%-ного рибофлавина.

     После этого роговицы переносили во флаконы с 5 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и добавляли 25 ЕД раствора коллагеназы на 24 и 72 часа. После этого препараты фиксировали в 2,5%-ном растворе глутарового альдегида, напыляли золотом и изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Исследование проводилось на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония).

    Результаты

    Роговицы первой группы являлись контрольными, и по результатам СЭМ следует, что строма роговицы была представлена пластинами строго ориентированных волокон белка коллагена (рис. 1). В строме роговиц второй группы отмечались утолщение коллагеновых фибрилл, уменьшение расстояния между пластинами коллагена, более компактная укладка пластин под воздействием рибофлавина и ультрафиолета по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Роговицы третьей группы после воздействия коллагеназы через 24 часа также сравнивались с контрольной группой: отмечалось разрушение коллагеновых фибрилл, нарушение продольной направленности пластин коллагена, нарушение структуры белка, визуализировались оставшиеся коагулированные части белковой фракции (рис. 3). Через 24 часа фибриллы коллагена роговиц четвертой группы, обработанные рибофлавином, ультрафиолетом и коллагеназой, сохраняли свою структуру и направленность, прослеживалась более компактная укладка пластин коллагена по сравнению с роговицами третьей группы (рис. 4). Динамическая оценка действия коллагеназы в третьей и четвертой группах через 72 часа показала, что в третьей группе наблюдалось отчетливое разрушение коллагена стромы, отсутствие какой-либо направленности волокон, визуализировались оптические пустоты в зонах разрушенного коллагена (рис. 5), в то время как в 4 группе воздействие коллагеназы было минимальным с сохранением структуры и направленности пластов коллагена (рис. 6).

    Обсуждение

    При анализе изображений СЭМ подтвержден факт «склеивания» фибрилл и утолщения коллагеновых волокон донорской роговицы под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения, более плотная упаковка пластин коллагена, уменьшение щелевидных пространств между пластинами. Такая архитектоника приводит к повышению биомеханической устойчивости ткани. При воздействии коллагеназы теряется четкая направленность волокон, а через некоторое время происходит разрушение структуры белка коллагена, что отчетливо видно при воздействии коллагеназы на нативную роговицу через 24 и особенно через 72 часа. После обработки донорской роговицы по методу кросслинкинга воздействие коллагеназы становится не столь разрушительным, сохраняется поперечная направленность пластин коллагена без признаков разрушения, с более компактной упаковкой и минимальными межщелевыми пространствами.

    Заключение

    Процедура кросслинкинга оказывает стабилизирующее физико-химическое воздействие на коллагеновые фибриллы роговичной ткани, увеличивает биохимическую устойчивость к действию протеолитических ферментов слезы и воспалительных клеток, что может быть эффективным в лечении заболеваний роговицы.