Актуальность
Распространение устойчивых к антибиотикам (АБ) бактерий представляет значительную угрозу заболеваемости и смертности во всем мире. Pseudomonas aeruginosa(PA) считается «критически приоритетным» микроорганизмом для тотальной эрадикации по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на основании таких критериев, как смертность пациентов и общие затраты на здравоохранение в процентном соотношении от общей совокупности патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [1].
Элиминация PA крайне сложна из-за способности к сверхадаптации в динамическом режиме, многофакторной вирулентности и комбинированной антибиотико-резистентности [2].
Патогенез развития инфекции, опосредованной РА, связан с рядом дополнительных особенностей микроорганизма, которые дают ему значительное преимущество в отношении других представителей инфекционного мира, а именно: адгезивная способность к биотическим и абиотическим поверхностям, гиперподвижность, множественная токсиногенность, способность к выработке молекул-эффекторов, оказывающих влияние на модуляцию сигнальных путей клеток-хозяев, разрушая внеклеточный матрикс последних; способность к образованию биопленок и локальных микробиомов, выдерживающих любые типы конкуренции с другими микроорганизмами, невозможность целевого воздействия АБ и дезинфицирующих растворов. МЛУ РА, в свою очередь, обеспечивается способностью к «лекарственному эффлюксу», продукцией ферментов инактивирующих АБ, а также механизмами генетической пластичности, в основе которых лежит горизонтальный перенос генов в ответ на селективное воздействие антиинфекционного агента [3–5].
Совокупность вышеописанных факторов агрессии и устойчивости выводит РА на лидирующие позиции в списке самых опасных инфекций для человеческого индивида.
В офтальмологической практике одним из самых разрушительных инфекционных заболеваний глаза является экзогенный эндофтальмит (ЭФ), в широком понимании. Тяжесть течения, визуальный и анатомический прогнозы этого заболевания зависят от вида попавшего в полость глаза возбудителя, факторов его агрессии и инвазии, а также сроков начатого лечения. Согласно данным исследований, ЭФ, вызываемый Гр– бактериями, составляет от 10,7 до 29,1%. Среди ЭФ данной группы РА составляет наибольшую долю – от 23,0 до 54,6 % [6–8].
Функциональные и анатомические результаты лечения ЭФ оставались и остаются крайне негативными, несмотря на ранние сроки проведения витрэктомии с интравитреальным введением (ИВВ) АБ широкого спектра действия [9–11]. На сегодняшний день исходы перенесенного ЭФ, опосредованного РА, в 50% случаев заканчиваются эвисцерацией глазного яблока, и только 5% пациентов получают остроту зрения выше движения рук у лица [12].
На основании вышеизложенного поиск средств, эффективно подавляющих жизненные функции PA, является чрезвычайно важной проблемой не только офтальмологов, но и всего медицинского сообщества.
В этой связи особую актуальность приобретают исследования наночастиц, в частности квантовых точек (КТ), которые продемонстрировали отсутствие токсичности в исследованиях на лабораторных животных [13, 14], а также показали высокую антиинфекционную активность в лабораторных условиях в отношении потенциальных возбудителей глазных инфекционных заболеваний, в частности РА [15, 16].
КТ, являясь универсальными донорами неспаренных электронов под действием источника возбуждения, способны к образованию различных типов супероксидных радикалов внутри бактериальной клетки. Нанометровый размер кристалла КТ, а также моделируемые оптические и электронные свойства позволяют использовать их отдельно или в составе комплексов с существующими антибактериальными агентами для получения аддитивного и синергетического эффектов [17–20].
Цель
Оценка эффективности лечения ЭФ, вызванного синегнойной инфекцией с МЛУ, с помощью конъюгатов на основе КТ в эксперименте.
Материал и методы
В качестве объекта исследования использовались лабораторные кролики породы шиншилла (n=27), мужского пола, в возрасте от 3,0 до 3,5 месяца (в среднем 3,2±1,5 мес.), массой от 3,5 до 4 кг (в среднем 3,7±0,34 кг).
Животные содержались в условиях вивария в Научно- исследовательском институте Фтизиопульмонологии, г. Екатеринбург, согласно принципам этического кодекса, «Директива 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза», условия содержания включали в себя контроль суточного потребления корма и воды, суточное мониторирование температуры тела, анестезиологическое сопровождение; после заражения условия содержания лабораторных животных менялись в соответствии с условиями работы при заражении особо опасными инфекциями. Лабораторные животные содержались в изолированных боксах с приточно-вытяжной вентиляцией.
В качестве индуктора воспалительной реакции всем лабораторным животным (n=27) в правый глаз было выполнено ИВВ мультирезистентного штамма РА в объеме 0,05 мл и мутностью 0,5 по стандарту Макфарланда (рис. 1), выделенного от пациента с септическим поражением на базе ГАУЗ СО «Клинико-диагностический центр», г. Екатеринбург.
Предварительные данные лабораторного анализа на чувствительность к антибактериальным препаратам соответствовали штамму с МЛУ (рис. 2).
МЛУ определялась путем измерения диаметров зоны задержки роста (ЗЗР) PA на среде тестирования Мюллер – Хинтон агар с различными АБ (табл. 1).
В качестве основы для создания конъюгатов с АБ брались КТ типа Ag(10%):InP/ZnS MPA, представляющие собой 2-оболочечную структуру, диаметром 5±1,5 нм, допированные 10% молекулами серебра, обладающие дополнительными антиинфекционными свойствами (рис. 3), имеющими внешний вид темного гомогенного раствора (рис. 4), синтезированные по специальному техническому заданию в НИИ «Прикладной акустики» г. Дубна, Московская область; основы синтеза которых, а также оптические и люминесцентные характеристики КТ и конъюгатов на их основе изложены в нескольких источниках [13–16].
После индукции патологического процесса и постановки диагноза – острый ЭФ, животным производилось ИВВ лекарственных форм (конъюгатов) в соответствии с распределением по следующим подгруппам, по 3 кролика в каждой, в объеме 0,1 мл.
Подгруппы 1–3(n=9) – получали интравитреальную инъекцию 2,25 мг/0,1 мл Цефтазидима.
Подгруппа 4(n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA в нативной 10% концентрации, обоснована в [13–16].
Подгруппа 5 (n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA в 100-кратном разведении (0,1%)
Подгруппа 6 (n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA в 1000-кратном разведении (0,01%).
Подгруппа 7 (n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA 0.05 мл в стандартной 10% концентрации, в сочетании 2,25 мг/0,05 мл Цефтазидима (стандартного АБ, имеющего потенциальную активность в отношении Гр– микрофлоры, к которой относится РА) – конъюгат № 1
Подгруппа 8 (n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA 0,05 мл в 100-кратном разведении (0.1%), в сочетании 2,25 мг/0,05 мл Цефтазидима – конъюгат № 2.
Подгруппа 9 (n=3) – ИВВ раствора Ag(10%):InP/ZnS MPA 0.05 мл в 1000-кратном разведении (0,01%), в сочетании 2,25 мг/0,05 мл Цефтазидима – конъюгат № 3.
При мониторинге и статистической обработке результатов клинической реакции на лечение основное внимание уделялось клиническим параметрам, классифицируемым по шкале от 1 до 5, где 1 – низкая динамика, 5 – высокая:
1) динамика резорбции гипопиона (гипопион);
2) наличие воспалительных клеток в передней камере (феномен Тиндаля (ФТ);
3) динамика регресса патологической взвеси в витреальной полости (ультразвуковая сонография (УЗС));
4) динамика инволюции патологической неоваскуляризации радужной оболочки (радужка);
5) динамика реэпителизации роговицы, отсутствие или прекращение процессов истончения роговицы, уменьшение отека роговицы (роговица).
Динамическое наблюдение за течением клинического процесса производилось ежедневно на протяжении 1 недели, посредством фоторегистрации переднего отрезка (ФПО). ФПО производилась с помощью модульной фотощелевой лампы BQ 900, Haag-Streit (Швейцария). Подопытные животные туго пеленались, ассистент фиксировал голову кролика у лобного упора прибора, после чего осуществлялась фотофиксация.
УЗС выполнялась на ультразвуковом офтальмологическом B-сканере UD-8000, Tomey (Япония). После тугого пеленания кролика на контактную поверхность датчика наносился гель, исследование производилось путем наложения контактной части датчика на верхнюю и нижнюю поверхности волосистой части верхнего и нижнего век подопытного животного в шести меридианах.
По окончании эксперимента животные выводились из него посредством отправки для реабилитации и дальнейшего разведения в ветеринарной клинике ООО «Здоровье животных», г. Екатеринбург.
Математическую обработку полученных данных проводили посредством оригинального вычисления эффективности метода лечения – K, на основании показателя динамики обратного развития симптомов – k, где показатель динамики обратного развития симптомов характеризует качество состояния клинических параметров признака в среднем по группе животных:
Эффективность метода лечения характеризуется показателем:
Результаты
На 1-е сутки после внесения инокулюма РА в витреальную полость у всех лабораторных животных (n=27) были выявлены признаки острого ЭФ, которые сопровождались интенсивной гиперрефлективной воспалительной взвесью в витреальной полости по данным УЗС, отсутствием рефлекса (невозможность визуализации) глазного дна; в передней камере визуализировался гипопион разной интенсивности от 0,5 до 1,5 мм; интенсивность воспалительной реакции в передней камере варьировала от 1 до 3 по воспалительному ФТ; отек роговицы варьировал от локального до диффузного, практически во всех случаях наблюдались явления отека конъюнктивы глазного яблока с патологическим отделяемым, смешанная инъекция (рис. 5).
На основании полученных результатов животные были разделены на 3 группы в зависимости от выраженности клинических проявлений и скорости регресса симптоматики:
1-я группа – кролики из подгрупп 1–3 (n=9), получившие интравитреальную инъекцию 2,25 мг/0,1 мл Цефтазидима, характеризовались наименьшей динамикой в отношении обратного развития симптомов на протяжении 7-дневного периода наблюдения.
У животных данной группы во всех случаях присутствовали отек роговицы и конъюнктивы, смешанная инъекция глазного яблока, полнокровие сосудов радужной оболочки, экссудативная пленка в передней камере, о
Результаты мониторинга динамики обратного развития симптомов у кроликов 1-й группы представлены в таблице 2 согласно 5-балльной шкале оценки: 1 – низкая, 5 – высокая динамика изменения клинических параметров признака.
2-я группа – кролики из подгрупп 4–6 (n=9), получившие интравитреальные инъекции Ag(10%):InP/ZnS MPA 0,1 мл в стандартной 10% концентрации, 0,1 и 0,01% концентрациях, характеризовались умеренной положительной динамикой в отношении обратного развития симптомов на протяжении 7-дневного периода наблюдения.
У некоторых животных данной группы (2 из 9; 22,2%) присутствовал локальный отек роговицы, практически полностью отсутствовала смешанная инъекция глазного яблока (1 из 9; 10%), полнокровие сосудов радужной оболочки было выявлено в 3 случаях из 9 (33,3%), экссудативная пленка в передней камере, признаки гипопиона не были выявлены ни у одного животного, гиперрефлективная взвесь в витреальной полости со слабым рефлексом глазного дна присутствовала в 7 случаях из 9 (78%) (рис. 7).
Результаты мониторинга динамики обратного развития симптомов у кроликов 2-й группы приведены в таблице 3 согласно 5-балльной шкале оценки, где 1 – низкая, 5 – высокая динамика изменения клинических параметров признака. 3-я группа – кролики из подгрупп 7–9 (n=9), получившие интравитреальные инъекции Ag(10%):InP/ZnS MPA 0,1 мл в стандартной 10% концентрации, 0,1 и 0,01% концентрациях, в сочетании с 2,25 мг/0,05 мл Цефтазидима, характеризовались наилучшей положительной динамикой в отношении обратного развития симптомов на протяжении 7-дневного периода наблюдения.
Патологические проявления со стороны роговицы и передней камеры отсутствовали во всех случаях, радужная оболочка характеризовалась нормальным сосудистым рисунком, гиперрефлективная взвесь в витреальной полости патологического характера была выявлена в 1 случае из 9 (10%).
Результаты мониторинга динамики обратного развития симптомов у кроликов 3-й группы приведены в таблице 4согласно 5-балльной шкале оценки, где 1 – низкая, 5 – высокая динамика изменения клинических параметров признака.
Сравнительная характеристика результатов обратного развития симптомов у исследуемых групп представлена нарисунке 8.
Согласно показателю динамики обратного развития симптомов, при лечении первым и вторым методами (табл. 2, 3) наилучшее состояние клинических параметров наблюдается у признака «гипопион», признак УЗС характеризуется наихудшим динамическим показателем, динамика обратного развития симптомов по признакам ФТ, радужка и роговица практически одинакова. Третий метод лечения (табл. 4)демонстрирует одинаковую динамику развития клинических параметров по всем пяти признакам.
По эффективности первый метод лечения имеет самый низкий показатель, третий метод лечения является наиболее эффективным.
Обсуждение
На сегодняшний день инфекция, вызываемая PA, является крайне важной нерешенной проблемой медицины и, в частности, офтальмологии. Современные АБ часто не могут обеспечить эрадикации синегнойной инфекции из организма носителя как при местном, так и при системном применении.
В этом ключе перспективы использования КТ в качестве адъювантов в лечении могут позволить повысить лечение таких инфекций. Область потенциального противомикробного воздействия КТ заключается в изменении состава, формы и размера фотовозбужденной КТ и модуляции положения зоны проводимости и валентной зоны. Это приводит к избирательному возмущению окислительно-восстановительного гомеостаза в микробной клетке, за чем следует ее повреждение или полной элиминация.
В данной работе авторами впервые проведено лечение эндофтальмита, вызванного штаммом PA c МЛУ, при этом не было получено признаков токсичности, а также статистически достоверно доказана высокая эффективность лечения.
Однако существует и ряд ограничений. В отечественной и зарубежной научной литературе по данному направлению – недостаточное количество данных в силу того, что такое исследование проводится впервые и не имеет аналогов в настоящее время. На данный момент не определена минимальная ингибирующая концентрация КТ, не решены вопросы фармакодинамики и фармакокинетики, не определены пути и сроки выведения КТ из полости глазного яблока. Все это затрудняет разработку и регистрацию лекарственных препаратов. Эти вопросы требуют дальнейших исследований и в перспективе будут решены.
Заключение
На основании полученных результатов в ходе проведенного исследования можно сделать следующие выводы.
1. Клинически и математически доказана эффективность лечения экспериментального антибиотико-резистентного ЭФ, вызванного штаммом РА с МЛУ, посредством лекарственного средства на основе КТ – Ag(10%):InP/ZnS MPA 0,1 мл в стандартной 10% концентрации, 0,1% и 0,01% концентрациях.
2. Клинически и математически доказана большая эффективность лечения экспериментального антибиотико-резистентного ЭФ, вызванного РА с МЛУ, с помощью конъюгата на основе КТ – Ag(10%):InP/ZnS MPA 0,1 мл в стандартной 10% концентрации, 0,1% и 0,01% концентрациях, в сочетании с 2,25 мг/0,05 мл Цефтазидима, что доказывает эффективное взаимодействие АБ и КТ, описанных в литературе [13–16].
3. На основании полученных результатов можно предположить, что активное исследование и использование КТ в качестве конъюгатов с современными АБ могут решить совокупную задачу по борьбе со штаммами с МЛУ, минимизировать риск их селекции, а также улучшить функциональные и анатомические результаты лечения пациентов с инфекционной воспалительной офтальмопатологией.
Информация об авторах
Вячеслав Олегович Пономарев, к.м.н., врач-офтальмохирург, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610.
Виктор Николаевич Казайкин, д.м.н., врач-офтальмохирург, victorru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906.
Константин Андреевич Ткаченко, врач-офтальмолог, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364.
Владимир Леонидович Тимофеев, врач-офтальмохирург, vltimof92@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7372-3870.
Андрей Геннадьевич Дудоров, инженер-конструктор, dandrew1367@gmail.com.
Information about the authors
Vyacheslav O. Ponomarev, PhD in Medicine, Ophthalmic surgeon, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610
Viktor N. Kazajkin, Doctor of Sciences in Medicine, Ophthalmic surgeon, victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906
Konstantin A. Tkachenko, Ophthalmologist, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364.
Vladimir L. Timofeev, Ophthalmic surgeon, vltimof92@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7372-3870
Andrei G. Dudorov, Design engineer, dandrew1367@gmail.com.
Вклад авторов в работу:
В.О. Пономарев: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
В.Н. Казайкин: сбор, анализ и обработка материала, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
К.А. Ткаченко: сбор, анализ и обработка материала.
В.Л. Тимофеев: сбор, анализ и обработка материала, редактирование, подготовка статьи к публикации.
А.Г. Дудоров: математическая и статистическая обработка данных, научное редактирование.
Authors' contribution:
V.O. Ponomarev: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, writing, final approval of the version to be published.
V.N. Kazaikin: collection, analysis and processing of material, editing, final approval of the version to be published.
K.A. Tkachenko: collection, analysis and processing of material.
V.L. Timofeev: collection, analysis and processing of material, editing, preparing an article for publication.
A.G. Dudorov: mathematical and statistical data processing, scientific editing.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.
Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.
Поступила: 19.03.2023
Переработана: 12.05.2023
Принята к печати: 10.08.2023
Originally received: 19.03.2023
Final revision: 12.05.2023
Accepted: 10.08.2023
