Экспериментальное обоснование использования 1% раствора гидроксипропилметилцеллюлозы для защиты эндотелия заднего послойного трансплантата роговицы при его выкраивании низкоэнергетическим фемтосекундным лазером по инвертированной методике

    

    Актуальность

    Псевдофакичная буллезная кератопатия (ПБК) и первичная эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса являются наиболее частыми показаниями к проведению кератопластики [1]. При отсутствии у пациентов стойкой и необратимой деструкции коллагенового остова роговицы хирурги предпочитают использовать селективные методы кератопластики, в частности эндотелиальную кератопластику. Последняя существует в двух модификациях: задняя послойная кератопластика (ЗПК) и трансплантация эндотелия с десцеметовой мембраной (ТЭДМ). За прошедшие полтора десятилетия оба метода, по существу, стали стандартом лечения пациентов с патологией эндотелиального слоя роговицы, обеспечивая высокие функциональные результаты на фоне минимального количества операционных и послеоперационных осложнений [2]. Наряду с этим стоит отметить, что, по данным Европейского регистра трансплантации роговицы и клеток, ЗПК является преобладающим методом трансплантации роговой оболочки глаза. На 2021 г. частота выполнения ЗПК составляет более 46% от всех выполненных трансплантаций роговицы в Европе [3]. При ЗПК заготовку заднего послойного трансплантата чаще всего осуществляют при помощи микрокератома по методу M. Gorovoy (2006). Однако в последние годы получил распространение метод заготовки трансплантатов с использованием различных моделей фемтосекундных лазеров (ФСЛ) [4, 5]. Данная технология, осуществляемая со стороны эндотелиальной поверхности роговицы, в ряде исследований показала свои преимущества, обеспечив формирование очень тонкого и равномерного по толщине трансплантата, что, в свою очередь, дает профилактику гиперметропического сдвига послеоперационной рефракции пациента и более высокий функциональный результат [6]. Широкий диапазон настроек лазерного реза дает возможность хирургу заготовить трансплантат запланированных геометрических параметров (диаметр, толщина) и осуществить реальную персонализацию вмешательства для конкретного пациента [7]. Несмотря на вышеперечисленные преимущества лазерного выкраивания задних послойных трансплантатов, обращает на себя внимание ряд публикаций, отмечающих факт большей потери эндотелиальных клеток (ЭК) после операций, в ходе которых при формировании трансплантата использовали ФСЛ, в сравнении с микрокератомом [8–10]. При этом нами найдены лишь единичные работы, в которых обсуждается возможность применения различных технологий защиты эндотелия роговицы [11–14]. Последний, как известно, является монослоем высокодифференцированных специализированных клеток, которые крайне чувствительны к разным видам травматических воздействий (механических, гидравлических, лазерных, химических и пр.). В этой связи актуальной представляется проблема поиска оптимальных вариантов протекции эндотелиального слоя в ходе выкраивания роговицы ФСЛ для повышения результативности оперативных вмешательств данного типа.

    Цель

    В эксперименте на изолированных роговицах свиней изучить степень повреждения эндотелия роговицы при выкраивании послойного трансплантата задних слоев роговицы ФСЛ с и без использования вископротекции раствором 1% гидроксиметилпрпилцеллюлозы (ГПМЦ).

    Материал и методы

    Нами использованы 32 корнеосклеральных диска, полученных из свежеэнуклеированных свиных глаз 16 особей. Следует подчеркнуть, что до забора глаза не подвергались термической или химической обработке. Время от забоя животного до энуклеации составило в среднем 5 мин, а от энуклеации до выкраивания корнеосклерального диска – 6±2 ч. После заготовки полученный материал помещали во флаконы со средой для хранения роговицы (ТУ 9393-013-29039336-2007, производства ООО «НЭП Микрохирургии глаза», Россия). Время от начала консервации до начала эксперимента составляло в среднем 12±3 ч. Роговицы были разделены на 2 группы. Один корнеосклеральный диск от каждого ксенодонора являлся контрольным, другой, парный, служил опытным образцом.

    Дальнейшие манипуляции проводили в стерильных условиях операционной. Корнеосклеральный диск извлекали из флакона со средой для хранения роговицы и фиксировали в специальном держателе – искусственной передней камере (ИПК) производства компании Ziemer (Швейцария) эндотелиальной стороной вверх. Затем при непрерывной подаче сбалансированного солевого раствора заполняли ИПК под давлением 50 мм вод.ст., что было оптимальным для поддержания объема ИПК, разглаживания складок роговицы и распределения давления на эндотелий роговой оболочки при его контакте с интерфейсом лазера [15]. Для оценки целостности эндотелиального слоя на его поверхность наносили 1–2 капли 0,1% раствора трипанового синего (ТС) (Vision Blue, DORC, Нидерланды) с последующим его смыванием средой для хранения роговицы. Осуществляли фото/видеофиксацию степени окрашивания роговичного диска.

    Послойный роговичный трансплантат формировали при помощи ФСЛ LDV Z8 (Ziemer, Швейцария) с эндотелиальной стороны. В контрольной группе аппланацию головки лазера проводили по стандартной методике, с предварительным нанесением 1–2 капель раствора для хранения роговицы. В опытной (основная) группе непосредственно перед аппланацией головки и ФСЛ на эндотелий донорской роговицы наносили дисперсивный вискоэластик (ВЭ) – 1% раствор ГПМЦ (ТУ 9398-008-29039336-2009, ООО «НЭП Микрохирургии глаза») в количестве 2–3 капель. Выдерживали экспозицию 30 сек для равномерного растекания и распределения его по поверхности роговицы. Затем плавно осуществляли контакт интерфейса лазера и роговицы путем вращения резьбового аппланационного кольца на ИПК. Производили контроль и оценку аппланации посредством интегрированной в лазер системы оптической когерентной томографии (ОКТ) (рис. 1). Трансплантат формировали послойным и циркулярным лазерными резами по предварительно запрограммированным параметрам: глубина залегания горизонтального реза составляла 125 мкм, а диаметр – 8 мм. После остановки лазера вращением кольца в обратном направлении плавно отсоединяли головку лазера от поверхности донорской роговицы. Роговицу, находящуюся в ИПК, помещали под операционный микроскоп Lumera 700 Rescan (Carl Zeiss Meditec, Германия), на ее поверхность наносили 1–2 капли ТС – тем самым осуществляли контроль нахождения остатков ВЭ на поверхности эндотелия роговицы. Затем окрашенный ВЭ смывали раствором для консервации роговиц. На поверхность роговицы дополнительно наносили несколько капель этого же красителя с целью оценки степени окрашивания эндотелиального слоя роговицы и, соответственно, его относительной жизнеспособности (при этом большая выраженность окрашивания свидетельствует о значительной потере клеток, так как прокрашиваются не сами клетки, а участки оголенной десцеметовой мембраны). На следующем этапе смывали ТС несколькими каплями среды для хранения роговицы. Дополнительно верифицировали состоятельность послойного реза ФСЛ при помощи ОКТ, интегрированного в операционный микроскоп. На каждом этапе выполняли фото/видеорегистрацию с помощью операционного микроскопа (рис. 2).

    На финальных этапах выкроенный трансплантат отделяли при помощи шпателя-расслаивателя от подлежащей стромы и переносили его в емкость со средой для хранения роговицы. В лабораторных условиях для определения жизнеспособности ЭК и кератоцитов трансплантат окрашивали флуоресцентным красителем Live and Dead Cell Assay (Abcam, Великобритания) по протоколу производителя который включал в себя 3-кратное промывание образцов стерильным раствором PBS, далее к каждому образцу добавляли 50 мкл готового красителя Live and Dead на 10 мин при комнатной температуре, с последующим однократным промыванием стерильным раствором PBS. Анализ образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе FluoView FV10i (Olympus, Япония), исследования проводили с обеих сторон: эндотелиальной (рис. 3)и стромальной (рис. 6). Далее образец фиксировали и дегидратировали в ацетоне восходящей концентрации, с последующей сушкой в критической точке в парах CO₂ (Quorum Technologies, Великобритания). Полученные дегидратированные образцы фиксировали на алюминиевом столике с помощью токопроводящего скотча, с последующим напылением золота в высоком вакууме в течение 30 сек (JEOL, Япония). Исследование образцов проводили на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) JCM-6000 Plus (JEOL, Япония).

    Подсчет числа ЭК и кератоцитов послойных трансплантатов проводили с помощью программного обеспечения ImageJ (Fiji, США). Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программ Statistica 10 (StatSoft, США) и Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, США). Характер распределения данных оценивали с использованием критерия Шапиро – Уилка. Данные представлены в формате Me [Q₁; Q 3], где Me – медиана, Q₁и Q₃– нижний и верхний квартили соответственно. Сравнение данных между группами выполняли с использованием U-критерия Манна – Уитни). Статистически значимым принимали уровень достоверности (p) менее 0,05 (p<0,05).

    Результаты

    По данным ОКТ ФСЛ в ходе аппланации во всех образцах опытной и контрольной групп отмечался ровный непрерывный профиль зоны контакта между головкой лазерного интерфейса и клетками эндотелия. Также мы не выявили складок эндотелия и стромы роговицы (рис. 1).

    Использование ТС для исследования относительной потери плотности ЭК после выкраивания трансплантата не показало визуальных отличий в опытной и контрольных группах. На интраоперационном ОКТ в обеих группах визуализировали состоятельный и непрерывный горизонтальный лазерный разрез, который был параллелен относительно эндотелиальной поверхности трансплантата (рис. 2).

    По данным конфокальной микроскопии общее количество ЭК в контрольной и опытной группах составляло 3570 [3486; 3613] и 3863 [3801; 4044] кл/мм² соответственно (таблица). При исследовании жизнеспособности ЭК в контрольной и опытной группах количество живых и мертвых ЭК статистически достоверно отличались (рис. 4). Живых ЭК было 2854 [2819; 2879] кл/мм² , что составляет 80,35±0,88%; и 3477 [3426; 3719] кл/мм² , что составляет 90,27±1,33% соответственно (p<0,001). Количество мертвых ЭК в контрольной группе было на 9,92±1,11% больше, чем в опытной, и составляло 710 [649; 728] кл/мм² , что равняется 19,65±0,88%; и 402 [366; 427] кл/мм² , что равняется 9,73±1,33% соответственно (p<0,001). Результаты сканирующей электронной микроскопии эндотелиальной стороны трансплантата демонстрируют сохранение гексагональной формы ЭК и целостности клеточных мембран в обеих группах, что подтверждает результаты флуоресцентного сканирующего исследования живых и мертвых эндотелиоцитов (рис. 5).

    При изучении повреждающего воздействия лазерного излучения на кератоциты трансплантата в момент выкраивания было выявлено, что в группе с ВЭ повреждение кератоцитов снизилось на 35% на нулевой глубине, что соответствует горизонтальному резу ФСЛ, на 27% на глубине 13 мкм, на 9% – на 26 мкм (рис. 6). Далее данные были сопоставимы в обеих группах и достоверных отличий не выявлено. При использовании 3D-моделирования в конфокальном микроскопе были построены карты исследуемых образцов, которые наглядно показывают повреждения кератоцитов на различной глубине трансплантата (рис. 6).

    При анализе изображений сканирующей электронной микроскопии стромальной стороны трансплантата имела незначительные единичные разволокнения стромы в обеих группах (рис. 5).

    Обсуждение

    Заготовка заднего послойного трансплантата роговицы для ЗПК является важным этапом в достижении успешного хирургического лечения пациентов с ПБК и различными видами эндотелиальных дистрофий. Идеальный трансплантат должен иметь минимальную толщину, равномерную форму, хорошее качество стромального интерфейса и оптимальную жизнеспособность эндотелиального слоя. Известно, что одним из ведущих механизмов сохранения долгосрочной прозрачности трансплантируемой роговицы является плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) и динамика ее потери. Известно, что снижение уровня ПЭК трансплантата носит прогрессирующий характер [16].

    При выкраивании трансплантатов с помощью ФСЛ возможен ряд механизмов дополнительной травмы ЭК. В частности, играет роль толщина выкраиваемого трансплантата: чем она меньше, тем травма ЭК более выражена. Это в том числе связано с коллатеральным энергетическим повреждением ткани роговицы. Известно, что при повышении энергии лазера клетки страдают в большей степени. Другой механизм заключается в механической травме и связан с работой шпателем в интерфейсе для рассечения перемычек и тканевых мостиков, оставшихся после фемтолазерного реза. С нашей точки зрения, одним из наиболее существенных является аппланация, при которой происходит прямой контакт интерфейса лазера (выполненного из жесткого гидрофобного пластика) со слоем клеток [17]. Ряд авторов, с целью уменьшения потери ПЭК, перед этапом аппланации рекомендуют наносить на поверхность ЭК вискоэластик [12–14].

    Однако использование вязких препаратов с высокой молекулярной массой (гиалуронат натрия, хондроитин сульфат или их комбинации) нарушает равномерность аппланации из-за неравномерного скопления ВЭ в интерфейсе. Так, C.C. Яковлева и соавт. в ходе экспериментальной работы обнаружили, что нанесение когезивного ВЭ на основе 1% гиалуроната натрия – Провиск (Алкон, США) на поверхность эндотелия сопровождается появлением складчатости роговицы при аппланации, что в дальнейшем после фемтодиссекции приводит к формированию неравномерного по толщине трансплантата и снижению качества его стромальной поверхности. В то же время отсутствие вископротекции отрицательно сказалось на качестве эндотелиальной поверхности [11]. В другом исследовании Y. Liu и соавт. продемонстрировали, что в группе, в которой использовали 1% гиалуронат натрия Провиск («Алкон», США) на этапе фемтореза, повреждение ЭК было меньше, чем в группе контроля, и составляло 10,6±3,2 и 23,4±7,6% соответственно. При этом нахождение ВЭ на эндотелии в зоне интерфейса донорской роговицы и ФСЛ на этапе аппланации не повлияло на качество стромальной поверхности трансплантата. Все трансплантаты в группе с вископротекцией эндотелия имели однородную форму и высокую жизнеспособность эндотелиоцитов [14].

    Использование менее вязких, адгезивных ВЭ препаратов, к которым относят ГПМЦ, дает возможность избежать вышеперечисленных проблем. Это подтверждается результатами нашего эксперимента, где в опытной группе с использованием ВЭ для защиты ЭК на этапе аппланации ПЭК трансплантатов была статистически достоверно выше, чем в контрольной группе. Также количество жизнеспособных клеток было больше в группе с ВЭ. Разница в потере ПЭК между группами была равна 9,92±1,11% в пользу ВЭ. А сравнение данных СЭМ стромальных поверхностей трансплантатов обеих групп не выявило достоверных отличий в качестве стромального интерфейса, данные в группах были сопоставимы.

    Наш выбор раствора ГПМЦ как протектора ЭК в момент аппланации основывался на экспериментальном исследовании S. Sikder и соавт. по применению различных видов ВЭ при аппланации головки лазера и донорской роговицы, с подсчетом потери ПЭК. Наиболее эффективно проявил себя в защите ЭК вискоэластик на основе 2% ГПМЦ, он показал наименьшую потерю ЭК в группе, равную 6%. В контрольной же группе, где не применялась защита ЭК и фемтодиссекция, потеря ПЭК только от аппланации рукоятки ФСЛ составила 9% [18].

    Нами была сделана пилотная попытка применения 2% ГПМЦ отечественного производства (ООО НЭП Микрохирургия глаза) и при этом было отмечено неравномерное скопление ВЭ в интерфейсе. Исходя из этого в работе был использован раствор ВЭ пониженной концентрации – 1% ГПМЦ. Преимуществом данного ВЭ является его низкая вязкость, обеспечивающая равномерное распределение раствора по поверхности роговицы, что предотвращает образование складок в момент аппланации.

    Таким образом, при выборе ВЭ следует соблюдать баланс между его вязкостью и эластичностью, при которых будет обеспечиваться достаточная защита ЭК и конгруэнтность поверхностей профиля роговицы и интерфейса ФСЛ в момент аппланации, которая влияет на качество фемтолазерного реза и, следовательно, на дальнейшие клиникофункциональные результаты в пост-операционном периоде.

    Имеется ряд публикаций, в которых описаны появления так называемого «хейза» (клиническое помутнение) в зоне прилегания трансплантата к строме реципиента (зоне интерфейса), при выкраивании ФСЛ заднего послойного трансплантата [19]. Повышенная оптическая плотность этой зоны, по мнению ряда ученых, может быть связана с активацией стромальных кератоцитов и отложением в зоне интерфейса продуктов их активации, таких как: депозиты липофусцина и кристаллина при формировании трансплантата с использованием ФСЛ [20, 21].

    В нашей работе при изучении влияния фемтолазерного излучения на строму и кератоциты в зоне горизонтального фемторазреза показано, что на уровне фемтодиссекции имеются незначительные повреждения кератоцитов, далее ущерб от ФСЛ снижался до уровня 91 мкм, на котором были обнаружены единичные поврежденные кератоциты. Глубже, в сторону эндотелиальной части трансплантата, мертвых кератоцитов не было обнаружено. Следовательно, на этой глубине заканчивается негативное влияние лазерного воздействия на кератоциты трансплантата. В опытной группе использование ВЭ на этапе аппланации незначительно повлияло на работу ФСЛ и уменьшило степень повреждения кератоцитов пропорционально дальности от горизонтального фемтореза. Исходя из заложенной в настройки ФСЛ целевой толщины трансплантата в 125 мкм, после формирования горизонтального фемтореза, до эндотелиального слоя роговицы оставалось в среднем 34 мкм интактной стромы. Данная настройка, по нашему мнению, оптимальна с точки зрения безопасности коллатерального воздействия лазерной энергии на трансплантат.

    Заключение

    Результаты экспериментального исследования показали, что нанесение слоя вискоэластика (1% раствор ГПМЦ) обеспечивает защиту эндотелия роговичного трансплантата на этапе выкраивания его низкоэнергетическим ФСЛ по инвертированной методике. При отсутствии защитного слоя ВЭ количество жизнеспособных ЭК трансплантата составило 80,3%, при этом в исследуемой группе, где использовали ВЭ, количество ЭК было на 9,92% выше. Также применение ВЭ обеспечило большее количество сохранных, жизнеспособных кератоцитов на разных расстояниях от фемтореза. Нахождение слоя ВЭ в интерфейсе между головкой ФСЛ и ЭК не препятствовало работе лазера, не влияло на формирование эффективного лазерного реза и не снижало качество стромальной поверхности трансплантата. Инвертированная методика заготовки трансплантата роговицы ФСЛ с использованием защитного слоя 1% раствора ГПМЦ, нанесенного на поверхность эндотелиального монослоя, может быть рекомендована для использования в клинической практике.

    

  &nbsp; Информация об авторах

    Борис Эдуардович Малюгин, д.м.н., профессор, зам. генерального директора по научной работе ФГАУ «НМИЦ «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493

    Сергей Анатольевич Борзенок, д.м.н., зав. Центром фундаментальных и прикладных проблем ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», mdborzenok@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9160-6240

    Иван Сергеевич Ткаченко, врач-офтальмолог, аспирант, dr.ivan.tka@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-1756-7911

    Дмитрий Сергеевич Островский, к.б.н., зав. лабораторией трансплантологии и клеточной биологии Центра фундаментальных и прикладных медикобиологических проблем ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», dmitriyostrovskiy@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102

    Светлана Юрьевна Калинникова, врач-офтальмолог, аспирант, svkalinnikova@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-9109-2400

    Information about the authors

    Boris E. Malyugin, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Deputy Director General for Scientific Work, boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493

    Sergey A. Borzenok, Doctor of Science in Medicine, Head of the Center for Fundamental Science, mdborzenok@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9160-6240

    Ivan S. Tkachenko, Ophthalmologist, PhD Student, dr.ivan.tka@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-1756-7911

    Dmitriy S. Ostrovskiy, PhD in Biology, Head of the Laboratory of Transplantology and Cell Biology of the Center for Fundamental Science, dmitriyostrovskiy@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102

    Svetlana Yu. Kalinnikova, Ophthalmologist, PhD Student, svkalinnikova@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-9109-2400

    Вклад авторов в работу:

    Б.Э. Малюгин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование.

    И.С. Ткаченко: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, редактирование.

    С.Ю. Калинникова: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных.

    Authors' contribution:

    B.E. Malyugin: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    S.A. Borzenok: significant contribution to the concept and design of the work, editing.

    I.S. Tkachenko: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    D.S. Ostrovskiy: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical data processing, editing.

    S.Yu. Kalinnikova: collection, analysis and processing of material, statistical data processing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 18.07.2023

    Переработана: 11.08.2023

    Принята к печати: 16.08.2023

    Originally received: 18.07.2023

    Final revision: 11.08.2023

    Accepted: 16.08.2023