Кросслинкинг (перекрестное сшивание) – образование дополнительных химических связей между макромолекулами, приводящее к увеличению прочности ткани. Уже более 10 лет данный метод успешно применяется для лечения кератэктазий [5-8]. Высказываются предположения о перспективности использования кросслинкинга (перекрестного сшивания) склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А (UVA) при прогрессирующей близорукости.
В ряде экспериментальных работ было показано положительное влияние кросслинкинга на биомеханическую прочность склеральной ткани, замедление прогрессирования смоделированной близорукости [4, 9-11]. Однако, лишь единичные работы посвящены гистологическим изменениям, происходящим в склере и других структурах глазного яблока под воздействием ультрафиолетового облучения в присутствии фотосенсибилизатора [12, 13]. Недостаточно изучена возможность использования рибофлавина на основе декстрана при проведении процедуры. Отсутствует четкая система, обосновывающая выбор параметров ультрафиолетового облучения. Кроме того, все исследования проводились с применением аппаратов, предназначенных для проведения фотохимического кросслинкинга роговицы, а не склеры. Их применение в клинике для ультрафиолетовой обработки экваториальных и заднеполярных областей фиброзной оболочки крайне затруднительно или совсем невозможно.
В связи с этим актуальной является комплексная экспериментальная разработка метода SCXL с рибофлавином/UVA.
Цель
Обосновать эффективность и безопасность перекрестного сшивания коллагена склеры под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения.
Материал и методы
Экспериментальные исследования проводились на кадаверных свиных глазах, а также глазах кроликов in vivo и ex vivo.
Влияние SCXL с рибофлавином и UVA на биомеханические свойства склеральной ткани исследовано на 95 кадаверных свиных глазах. На каждом глазу в сагиттальном направлении, начиная от зрительного нерва, выкраивали по 2 параллельных склеральных лоскута размером 4×10 мм. Размеры их определяли с помощью цифрового штанген-циркуля. Один из образцов склеры каждого глазного яблока подвергался процедуре кросслинкинга (опытная группа), в которой насыщали 0,1%-м водным раствором рибофлавина-мононуклеотида путем инстилляции в течение 20 минут с последующим облучением ультрафиолетом А с длиной волны 370±5 нм и мощностью 3 мВт/см² в течение 30 минут с дополнительной инстилляцией раствора фотосенсибилизатора каждые 5 минут. Второй парный образец оставался интактным (контрольная группа). Полученные склеральные лоскуты растягивали вдоль продольной оси на разрывной установке до их полного разрыва. При этом фиксировали величину растяжения образца и затрачиваемую на это силу. Сравнение биомеханической прочности образцов склеры производили по показателям предела прочности и модуля Юнга.
Также было исследовано влияние SCXL с рибофлавином и UVA на структуру склеральной ткани. Для этого были использованы 15 кадаверных свиных глаз, из которых в сагиттальном направлении, начиная в 2 мм от лимба, выкраивали по 2 параллельных склеральных лоскута прямоугольной формы, размером 4×10 мм. Один из образцов склеры каждого глазного яблока подвергался процедуре SCXL (опытная группа), второй парный образец оставался интактным (контрольная группа). Затем склеральные лоскуты фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, после проводки через спирты образцы заливали в парафин и готовили гистологические срезы, которые окрашивали по Ван Гизону. Визуальный анализ препаратов выполняли на световом микроскопе Axiostar Plus (Carl Zeiss) при различных увеличениях.
Для оценки влияния SCXL с рибофлавином и УФ-А на ультраструктуру склеральной ткани были использованы также 11 кадаверных свиных глаз, из которых выкраивали по 2 параллельных склеральных лоскута прямоугольной формы, размером 4×10 мм. Один из образцов подвергался процедуре кросслинкинга (опытная группа), второй парный образец оставался интактным (контроль). Образцы склеры соответствующим образом готовили. Сравнительный анализ диаметра коллагеновых фибрилл осуществляли с использованием фотографических изображений (увеличение ×10000) при помощи программного обеспечения Olympus iTEM для анализа электронограмм [14].
Расчет показателя поглощения ультрафиолетового излучения группы А склеральной тканью проводили на 60 кадаверных свиных глазах (60 образцов склеральной ткани) и 30 свежеэнуклеированных глазах кроликов породы шиншилла (30 образцов склеральной ткани). Выкраивали склеральный лоскут прямоугольной формы, размером 12х15 мм. Толщину склерального образца измеряли с помощью цифрового штангенциркуля. Половину полученных образцов насыщали 0,1%-м водным раствором рибофлавина мононуклеотида (30 образцов свиной склеры, 15 образцов склеральной ткани кроликов), половину – оставляли интактными (30 образцов свиной склеры, 15 образцов склеральной ткани кроликов). В качестве источника UVA использовали светодиод (Roithner Laser Technik, UVLED 370-10E, Австрия), закрепленный в горизонтальной плоскости. Мощность ультрафиолетового излучения измеряли с помощью УФ-радиометра, по показанию прибора определяли проходящую через него мощность УФ-излучения [15].
По формуле вычисляли показатель поглощения ультрафиолета А склерой.
Сравнение влияния фотосенсибилизаторов (ФС) на водной и декстрановой основах на проницаемость склеральной ткани для ультрафиолетового излучения группы А выполняли на 60 кадаверных свиных глазах, которые были разделены на 2 группы (в одной использовали 0,1%-й водный раствор рибофлавина мононуклеотида, во второй – 0,1%-й раствор рибофлавина мононуклеотида на 20%-й декстрановой основе). Выкраивали склеральный лоскут прямоугольной формы, размером 12х15 мм, лоскуты насыщали ФС в течение 20 минут. В качестве источника УФ-А использовали светодиод (Roithner Laser Technik, UVLED 370-10E, Австрия), закрепленный в горизонтальной плоскости. Мощность ультрафиолетового излучения измеряли с помощью УФ-радиометра, по показанию прибора определяли, проходящую через него мощность УФ-излучения. Измерение проводили в течение 30 минут.
Оценку сохранности структур глаза после проведения кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA проводили на 34 кроликах (68 глаз) in vivo. На правых глазах выполняли процедуру SCXL с рибофлавином/ультрафиолетом А, левые – служили контролем. В послеоперационном периоде проводили местную антибактериальную и противовоспалительную терапию в течение 1 недели.
Офтальмобиомикроскопическое исследование выполняли с помощью фотощелевой лампы на 1, 7, 14 и 30 сутки после операции. Оценивали состояние конъюнктивы, склеры, роговицы, влагу и глубину передней камеры, радужку, хрусталик, стекловидное тело; проводили осмотр глазного дна при помощи бесконтактных асферических высокодиоптрийных линз 78 и 90 D.
С помощью оптической когерентной томографии сетчатки (ОКТ) до начала эксперимента, а также на 1, 7 и 30 сутки после операции оценивали состояние слоев сетчатки, хориоидеи и склеры, а также проводили измерение их толщины.
Оценку функционального состояния нейрорецепторных элементов сетчатки проводили на 15 кроликах (30 глаз) путем регистрации электроретинограммы (ЭРГ – палочковой, колбочковой и максимальной) до операции в интактном состоянии и через 1, 7 и 30 дней после операции. Данные, полученные после хирургического вмешательства, в ходе эксперимента сравнивались с дооперационной нормой и дополнительным контролем (левый интактный глаз).
Использовали также метод световой микроскопии. Для этого 15 кроликов выводили из эксперимента через 1 сутки, 1 неделю и 1 месяц после операции (по 5 животных на каждый срок). Глаза энуклеировали и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Выкраивали облученный участок склеры с прилежащими внутренними оболочками, роговицей и зрительным нервом, проводили его через спирты, заливали в парафин, готовили гистологические срезы, окрашивая их гематоксилин-эозином [16-19].
С применением устройства «УФалинк С» SCXL с рибофлавином/ультрафиолетом А провели на 66 кроликах (132 глаза), причем на правом глазу выполняли процедуру кросслинкинга, а левый служил контролем. Кросслинкинг склеры проводили под внутримышечной анестезией препаратом ксилазин и местной анестезией 0,4%-м инокаином. После установки блефаростата в верхне-внутреннем секторе выполняли паралимбальный разрез конъюнктивы и теноновой оболочки длиной около 1 см для подхода к склеральной ткани. Через полученный разрез тупым путем формировали карман между склерой и теноновой оболочкой, в который инстиллировали 0,1%-й водный раствор рибофлавина мононуклеотида шприцем с канюлей. Таким образом насыщали склеру ФС в течение 20 минут.
Облучение фиброзной оболочки ультрафиолетом А выполняли с помощью устройства «УФалинк С» (длина волны – 370 нм, мощность излучения – 3 мВт/см²), разработанного в Уфимском НИИ глазных болезней специально для проведения кросслинкинга склеры (патент на полезную модель №144673 от 28.07.2014 г.): излучатель аппарата вводили в сформированный карман и обеспечивали воздействие UVA на склеру в течение 30 минут (6 циклов по 5 минут).
В промежутках между циклами дополнительно инстиллировали ФС в течение 20-30 секунд. После завершения облучения на конъюнктиву накладывали 1-2 узловых шва 8/0. В послеоперационном периоде проводили антибактериальную и противовоспалительную терапию в течение недели.
Животных выводили из эксперимента через 1 сутки, 1 неделю и 1 месяц после операции. Глаза энуклеировали и фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина. Выкраивали облученный участок склеры с прилежащими внутренними оболочками и частью косой экстраокулярной мышцы, попадавшей в зону облучения, а также зрительный нерв. Морфологические исследования данных структур проводили для выявления прямого или опосредованного повреждающего воздействия кросслинкинга. В контрольной группе выкраивали соответствующий участок. Полученные образцы проводили через спирты и заливали в парафин. Готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Визуальный анализ препаратов и фотоснимки проводили с помощью светового микроскопа Leica DME при различных увеличениях.
Результаты
Рис. Оптическая когерентная томография кроликов. 1-е сутки после проведения процедуры SCXL. А) опыт; Б) контроль
Таблица 1 Биомеханические показатели опытных и контрольных склеральных образцов
Как видно из таблицы 1, в результате SCXL с рибофлавином/УФ-А наблюдалось статистически достоверное увеличение прочностных характеристик склеральной ткани (предел прочности увеличился на 77%, модуль Юнга – на 63%).
При световой микроскопии на фотоснимках гистологических препаратов склеры признаков патологических изменений ее структуры в результате кросслинкинга не наблюдалось. Проведенный морфометрический анализ фотоснимков гистологических препаратов позволил судить о влиянии SCXL на плотность упаковки склеральной ткани. В результате егo проведения наблюдали статистически достоверное увеличение плотности упаковки коллагеновых волокон в среднем на 8% (с 57,97% – в контроле до 66,63% – после SCXL) и уменьшение площади межуточного пространства в среднем на 5% (c 14,24% до 8,96% соответственно).
Электронно-микроскопические исследования в обеих группах показали наличие регулярно чередующихся зон зазора фибрилл (располагающихся параллельно друг другу), формирующих коллагеновые волокна. Исследование проводилось для оценки сохранности жизнеспособности фиброцитов склеры. Было показано, что склероциты сохраняют свою структурную целостность без повреждения стенки; визуализировались сохранные ядра, органоиды, цитоплазма. Проведенный анализ электронограмм показал, что в результате SCXL с рибофлавином/UVA происходит достоверное увеличение диаметра коллагеновых фибрилл в среднем на 12%, плотности упаковки – на 15%.
Таким образом, результаты свидетельствовали об относительно высокой устойчивости склеральной ткани к повреждающему воздействию ультрафиолетового излучения. Увеличение диаметра коллагеновых фибрилл и более плотное расположение волокон склеры в результате кросслинкинга связаны с образованием дополнительных перекрестных связей.
Показатель поглощения ультрафиолета А кадаверной свиной склерой составил в среднем 4,91±0,43 мм-1 , склерой кроликов – 11,70±1,27 мм-1 . Показатель поглощения ультрафиолета А кадаверной свиной склерой, насыщенной рибофлавином, составил в среднем 9,04±0,83мм-1 , склерой кроликов, насыщенной фотосенсибилизатором, – 16,2±0,72 мм-1 .
Полученные показатели использовались для расчета пороговых параметров ультрафиолетового облучения при проведении процедуры SCXL.
Средняя толщина склеральных лоскутов (l) в первой группе составила 0,72±0,08 мм, мощность падающего на них UVA – 3,003±0,007 мВт/см² ( ). Мощность прошедшего через склеральные образцы UVA ( ) составила 0,0 мВт/см² – склеральные образцы, пропитанные водным раствором рибофлавина, полностью задерживали падающий на них ультрафиолет. Через 5, 10, 15 и 30 минут ( ) наблюдаемая картина не менялась – UVA полностью задерживался склерой.
Лоскуты 2-й группы существенно не отличались по своей толщине от первой группы (l=0,74±0,07 мм). Их облучали ультрафиолетом аналогичной мощности (3,002±0,005 мВт/см²). Склеральные образцы, пропитанные декстран-содержащим ФС, не полностью задерживали ультрафиолет – мощность прошедшего через них UVA составила 0,011±0,004 мВт/см². С течением времени количество ультрафиолета, проходящего через лоскуты второй группы, постоянно увеличивалось: через 5 минут ( ) мощность UVA превысила первоначальную ( ) более чем в 3 раза, через 10 минут ( ) – в 7 раз, через 15 минут ( ) – в 9 раз. Через 30 минут мощность ультрафиолета, прошедшего через склеру, достигла 0,132±0,005 мВт/см² ( ), что более чем в 10 раз превышает первоначальное значение.
Относительно толстые образцы кадаверной свиной склеры, насыщенные ФС на основе декстрана, не полностью задерживали UVA «стандартной» мощности 3 мВт/см². Более того, с течением времени воздействия происходило увеличение мощности ультрафиолета, проходящего через склеру. Как известно, непрозрачность склеральной ткани прежде всего определяется содержанием в ней воды. Склера просветлевает, если этот показатель падает ниже 40%. В эксперименте происходила дегидратация склеры декстраном, соответственно повышалась ее прозрачность и проницаемость для UVA.
В противоположность этому, склеральные лоскуты, насыщенные водным раствором рибофлавина, полностью задерживали падающий на них ультрафиолетовый свет. Причем данный эффект сохранялся в течение всего периода УФ-облучения (до 30 минут). Наблюдаемое явление вполне логично и объясняется тем, что в данном случае рибофлавин служит не только ФС, но одновременно выступает и в роли фотопротектора.
Таким образом, склеральная ткань достаточной толщины, насыщенная 0,1%-м водным раствором рибофлавина, может полностью задерживать падающий на нее UVA мощностью 3 мВт/см², в связи с чем исключается цитотоксическое воздействие ультрафиолетового излучения на внутренние оболочки глаза. Другими словами, процедура SCXL с рибофлавином/ультрафиолетом А может быть безопасной с точки зрения воздействия на сетчатку при достаточной толщине склеры и использовании ФС рибофлавина на водной основе.
Был произведен расчет пороговых параметров ультрафиолетового облучения при проведении процедуры SCXL с рибофлавином и UVA в зависимости от толщины склеры. Зная показатель поглощения ультрафиолета А склерой и толщину склеральной ткани, можно рассчитать мощность ультрафиолетового излучения, необходимую для проведения SCXL в этой зоне, исключая его проникновение в глубжележащие слои глаза, а следовательно, и их повреждение.
Повреждающий порог излучения для сетчатки составляет 0,31 Дж/см². Подставив данное значение в преобразованную формулу закона Бугера-Ламберта-Бера, мы можем вывести уравнение, позволяющее рассчитывать пороговые параметры процедуры облучения склеры ультрафиолетом А:
где – пороговая доза облучения склеры, Дж/см²;E – повреждающий порог излучения для сетчатки, Дж/см²; t – время облучения склеры ультрафиолетом, с; e – основание натурального логарифма; k – показатель поглощения ультрафиолета А склерой, мм-1; l – толщина склеры, мм.
При проведении биомикроскопического исследования через 1 сутки после процедуры SCXL у кроликов наблюдались незначительные блефароспазм и инъекция конъюнктивы оперированного глаза. Нарушения прозрачности оптических сред не выявлялось. Воспалительные явления постепенно стихали и полностью исчезали через несколько дней после операции.
При офтальмоскопии экспериментальных животных во все сроки наблюдения хорошо просматривались как поверхность зрительного нерва, так и волокна медуллярной лучистости вокруг него. Определялась близкая к равномерной пигментация сетчатки.
Не было выявлено каких-либо патологических изменений после проведения SCXL и методом ОКТ, на ее снимках четко визуализировались слои сетчатки, хориоидея и склера (рис.). Измерения толщины оболочек глаз после проведенной статистической обработки полученных результатов не выявили статистически значимой разницы между исследованными группами (p>0,05).
Амплитудно-временные характеристики и форма ЭРГ экспериментального (правого) и контрольного (левого) глаз кроликов были идентичными во все сроки наблюдения, имели классический вид. Все волны ЭРГ хорошо выражены, что свидетельствует об удовлетворительном функциональном состоянии ретинальных нейрорецепторных механизмов. Проведенная статистическая обработка полученных результатов не выявила статистически значимой разницы между исследованными группами (p>0,05).
В дополнение к прижизненным методам оценки состояния сетчатки при воздействии SCXL нами было проведено гистологическое исследование методом световой микроскопии. При энуклеации оперированных глаз отмечалось свободное отделение конъюнктивы и теноновой оболочки от поверхности склеры, не было выявлено выраженного фиброзного процесса.
В роговице, сетчатке и зрительном нерве пролеченных глаз не было выявлено патологических изменений ни в один из сроков наблюдения.
Полученные биомеханические показатели склеральных лоскутов представлены в таблице 2.
Таким образом, в результате SCXL с рибофлавином/УФ-А наблюдалось статистически достоверное увеличение прочностных характеристик склеральной ткани (предел прочности увеличился на 71%, модуль Юнга – на 64%). В группах сравнения (только насыщение склеры ФС или только ультрафиолетовое облучение) статистически значимых изменений прочности склеры выявлено не было.
При этом, по данным световой микроскопии, в сетчатке и зрительном нерве пролеченных глаз не было выявлено патологических изменений ни в один из сроков наблюдения.
Выводы
1. В эксперименте доказано, что кросслинкинг с рибофлавином/ультрафиолетом А приводит к увеличению биомеханической прочности склеральной ткани, изменяя ее структуру и приводя к увеличению плотности упаковки коллагеновых волокон, уменьшению площади межуточного пространства и увеличению диаметра коллагеновых фибрилл. Это подтверждает образование дополнительных перекрестных связей между макромолекулами склеры. Установлено отсутствие каких-либо патологических изменений волокон фиброзной оболочки глаза.
2. Определена проницаемость склеральной ткани для ультрафиолетового излучения диапазона А. Показатель поглощения УФ-А кадаверной свиной склерой составил: интактной – 4,91±0,43 , насыщенной рибофлавином – 9,04±0,83 ; склерой кроликов: интактной – 11,70±1,27 , насыщенной рибофлавином – 16,2±0,72 . На основе полученных данных предложена формула для расчета порогового значения интенсивности ультрафиолетового облучения при проведении процедуры SCXL.
3. Методами световой микроскопии, электроретинографии и оптической когерентной томографии выявлено, что выполнение SCXL с рибофлавином/ультрафиолетом А при исследованных параметрах (3 мВт/см², 30 минут) безопасно для структур глаза (роговицы, сетчатки и зрительного нерва).
4. Разработана щадящая технология фотополимеризации склеры с использованием устройства «УФалинк С», преимуществом которой является возможность проводить ультрафиолетовое облучение труднодоступных участках глазного яблока (экватора и заднего полюса) через малые паралимбальные разрезы конъюнктивально-теноновой оболочки. При этом экспериментально доказано эффективное повышение биомеханических прочностных характеристик склеральной ткани и продемонстрировано отсутствие повреждающего воздействия на структуры глаза.
5. Рекомендуется клиническое исследование процедуры кросслинкинга склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А. Предложенные параметры SCXL (мощность 3 мВт/см², время облучения 30 минут c предварительным насыщением склеры 0,1%-м водным раствором рибофлавина) в экспериментах показали свою эффективность и безопасность. При проведении процедуры рекомендуется использовать фотосенсибилизатор рибофлавин на водной основе, без добавления декстрана, который приводит к дегидратации склеры и повышению ее проницаемости для ультрафиолетового света, что увеличивает риск повреждения внутренних оболочек глаза.
