Рис. 1. Относительная экспрессия генов семейства MAGE в образцах УМ человека. Представлены результаты анализа базы данных The Cancer Genome Atlas Program: а) доля образцов, положительных по определенному гену семейства MAGE; б) данные нормализованной экспрессии белоккодирующих генов семейства MAGE в образцах опухолей пациентов с увеальной меланомой. Данные представлены в виде TMM-значений ± SD, полученных при нормализации с помощью пакета edgeR
Fig. 1. Relative expression of MAGE family genes in human UM samples. Data are presented according to the analysis of The Cancer Genome Atlas Program database: а) percentage of MAGE-positive samples; б) Normalized expression data of MAGE family protein-coding genes in uveal melanoma samples. Data are presented as TMM values ± SD, obtained by normalization using the edgeR software.
Рис. 2. Относительный уровень экспрессии мРНК генов MAGE-A3/6 (а) и MAGE-D2 (б) в клетках культур УМ человека. Данные представлены как среднее значение экспрессии ± SD относительно клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF7; в) подтверждение синтеза продуктов ПЦР требуемого размера при анализе в 2% агарозном геле на примере культур клеток uMel8 и MCF7. Ген B2M (микроглобулин бета-2) использовали в качестве внутреннего контроля. M — маркер молекулярного веса
Fig. 2. Relative mRNA expression of MAGE-A3/6 (а) and MAGE-D2 (б) genes in human UM cells. Data are presented as mean expression value ± SD relative to human MCF7 breast adenocarcinoma cells; в) size confirmation of the PCR products when analyzed in 2% agarose gel, the example of uMel8 and MCF7 cells. The B2M (microglobulin beta-2) gene was used as an internal control. M — molecular weight marker
Актуальность
Увеальная меланома (УМ) — это опухоль нейроэктодермального происхождения, которая развивается в результате злокачественной трансформации меланоцитов увеального тракта: хориоидеи, цилиарного тела и радужки. УМ составляет 5% всех выявляемых случаев меланом и является крайне агрессивной, поскольку у половины пациентов с УМ развиваются метастатические формы заболевания с неблагоприятным прогнозом [1]. Частота заболевания УМ варьирует от 1 до 9 случаев на 1 млн человек в год. Редкая встречаемость заболевания не позволяет проводить широкомасштабные клинические испытания новых методов и препаратов, что ограничивает прогресс в его лечении [1]. Агрессивность метастатической формы УМ и существенные физиологические отличия от меланомы кожи определяют актуальность поиска новых препаратов, эффективных для ее лечения, прежде всего таргетных.
Для лечения метастатической формы УМ в 2022 г. были одобрены два таргетных препарата — тебентафусп, мишенью которого является белок gp100, и ингибитор протеинкиназы С даровасертиб (Darovasertib) [2].
Поэтому поиск специфических мишеней, подходящих для нацеливания терапевтических препаратов, остается актуальной задачей [3].
Нами ранее были получены 9 первичных культур клеток УМ из опухолевого материала пациентов, которые отличались морфологией клеток, представленностью поверхностных рецепторов и меланосом [2, 4]. Такие клеточные модели УМ позволяют выявлять уникальные молекулярные особенности заболевания — баланс клеточных органелл, мутационный ландшафт, транскрипционную активность генов, экспрессию регуляторных микроРНК, секреторную активность и представленность специфических белковых маркеров для таргетной терапии.
Белки семейства антигенов меланомы (melanoma antigene genes, MAGE) могут быть потенциальными мишенями для противоопухолевой терапии. Несмотря на название, большинство из них экспрессируются не только в меланоме, но и во многих опухолях различного гистогенеза [5].
В семейство генов MAGE входит более 50 представителей, каждый из которых содержит гомологичный высококонсервативный домен около 170 аминокислотных остатков, структура которого представляет собой два тандемных мотива спираль-поворот-спираль. Гены MAGE условно разделяют на два типа по локализации на хромосоме и специфичности тканевой экспрессии: гены I типа локализованы на Х-хромосоме и экспрессируются в семенниках и опухолях, в том числе в клетках меланомы [6], толстой кишки, легких, простаты, молочной железы и других; гены II типа не ограничиваются Х-хромосомой и в норме экспрессируются в некоторых тканях организма, например, в тканях мозга [7].
К I типу относятся подсемейства генов MAGE-A, MAGE-В и MAGE-С, ко второму — MAGE-D, -E, -F, -G, -H и -L. Гены MAGE I типа описаны как гены, кодирующие раково-тестикулярные антигены (сancer-testis antigens, СTА), которые распознаются как антигены Т-клетками [8]. Белки MAGE функционируют как субстрат-определяющие субъединицы E3-убиквитин-лигаз, поэтому их дисбаланс и нарушенная активность могут провоцировать онкогенез вследствие изменения регуляции убиквитинирования [6]. Белки MAGE взаимодействуют с определенными белками семейства RING (really interesting new gene), формируя стабильный мультисубъединичный комплекс E3-убиквитин-лигазы — MAGE-RING-лигазы, и многообразие белков MAGE обеспечивает селективное взаимодействие с многочисленными белковыми субстратами [9].
Так, например, показано, что усиление убиквитинлигазной активности комплекса MAGE-TRIM28 с белком TRIM28 (tripartite motif-containing protein 28) семейства RING ведет к уменьшению содержания в клетках опухолевого супрессора проапоптотического белка р53 за счет его деградации в протеосомах, хотя и в отсутствие MAGE TRIM28 тоже способен убиквитинировать р53. Гомология генов MAGE-A3 и MAGE-A6 (далее — MAGE-A3/6) составляет 96%, и они являются двумя наиболее часто активируемыми генами MAGE при онкологических заболеваниях [10]. MAGE-A3/6 также образует комплекс с TRIM28 [9], и основной мишенью такого комплекса является опухолевый супрессор AMPK̆1 (субъединица ̆1 AMP-активируемой протеинкиназы) [11]. В случае карциномы печени убиквитин-лигазные комплексы TRIM28 c MAGE-A3 или MAGE-C2 стимулируют деградацию в протеосомах фермента фруктоза-1,6-дифосфатазы, участвующего в глюконеогенезе, и также являющемся опухолевым супрессором [12].
Экспрессия мРНК MAGE-A3 встречается практически во всех типах рака, и MAGEA3-антиген является подходящей мишенью для иммунотерапии. Было показано, что в случае карциномы головы и шеи экспрессия мРНК MAGE-A3/6 является независимым маркером, ассоциированным с вероятностью рецидива опухоли [13].
Гены MAGE-D являются представителями семейства MAGE типа II и экспрессируются в мозге взрослого человека с наиболее сильными сигналами в коре и продолговатом мозге [14]. Белок MAGE-D2 играет ключевую роль в ответе на клеточный стресс, например гипоксию, регулируя уровень cAMP [15]. Недавно было показано, что MAGE-D2 высоко экспрессируется в 37% глиом высокой степени злокачественности и высокая экспрессия MAGE-D2 ассоциируется с плохим прогнозом [16].
Работ, демонстрирующих экспрессию генов MAGE при УМ, к настоящему моменту доступно мало, часть содержит противоречивые данные.
Цель
Оценка уровня экспрессии мРНК генов MAGE-A3/6 и MAGE-D2 в клетках персональных культур УМ человека как потенциальных мишеней для таргетной терапии.
Материал и методы
Персональные культуры клеток увеальной меланомы
Опухолевый материал для создания персональных культур клеток был получен в результате энуклеаций, проведенных в Новосибирском филиале ФГАУ «НИМЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» Минздрава России от 9 пациентов с диагнозом «увеальная меланома хориоидеи». Забор опухолевой ткани проводили на основании информированного согласия пациента. Первичные культуры клеток были получены, как было описано ранее [4]. Кратко, дезинтеграцию ткани проводили механически, диссоциированные клетки культивировали на среде Minimum Essential Medium α (α-МЕМ) с нуклеозидами со следующими добавками: 10% FBS, 1× GlutaMAX, 2× антибиотика-антимикотика (все реагенты производства GIBCO, Thermo Fisher Scientific, США), 5 мкг/мл инсулина и 20 нг/мл эпидермального фактора роста человека («СайСТорЛаб», Россия). Клетки культивировали во флаконах с площадью поверхности 25 см2 (TPP, Швейцария) в условиях 37,0±1,0 °С в атмосфере 5,0±0,5% СО2 (далее — стандартные условия).
Культивирование клеток MCF7, U87-MG, U251-MG, SH-SY5Y, А375
В работе использовали клетки аденокарциномы молочной железы MCF7, глиобластом U87-MG, U251-MG, нейробластомы SH-SY5Y и меланомы кожи А375. Клеточная линия SH-SY5Y была любезно предоставлена из коллекции ФБГУ «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии» (г. Москва, Россия), культуры глиобластом и аденокарциномы — центром коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных» (г. Санкт-Петербург, Россия), меланомы кожи — из коллекции клеточных культур ЗАО «Исследовательский институт химического разнообразия» (г. Химки, Россия). Клетки культивировали в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см2 (TPP, Швейцария) в ростовой среде Minimum Essential Medium α (α-МЕМ) для клеток U87-MG, U251-MG, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) для клеток SH-SY5Y и А375 и Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) для клеток MCF7 в присутствии 10% FBS, 1×GlutaMAX, 1× антибиотикаантимикотика (все реагенты производства GIBCO, Thermo Fisher Scientific, США) в стандартных условиях.
Анализ баз данных
Даные полнотранскриптомного секвенирования образцов опухолей 80 пациентов с увеальной меланомой были загружены с базы данных The Cancer Genome Atlas Program (TCGA) [17]. Данные количества прочтений были нормализованы с помощью пакета edgeR версии 3.40.1 [10.1093/nar/gkaf018] с использованием стандартных параметров функций.
Выделение суммарной клеточной РНК и ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Клетки, растущие в лунках культурального планшета или во флаконе, промывали раствором PBS (Amresco, США), а затем открепляли от подложки добавлением реагента Tryple (GIBCO, США). Выделение РНК производили путем лизирования клеточных образцов набором для выделения суммарной РНК из реагента «Лира» («Биолабмикс», Россия), как рекомендовано производителем.
Для определения концентрации РНК оптическую плотность растворов измеряли с помощью спектрофотометра NanoVue Plus (GE Healthcare Life Sciences, США) при длинах волн 260/280, затем проводили обработку образца ДНКазой I (Thermo Scientific, США) из расчета 0,1 ед. на 1 мкг РНК. Количественное определение РНК выполняли с использованием набора Qubit RNA BR (Invitrogen, США) и флуориметра Qubit Fluorometer (Invitrogen, США).
Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые в качестве праймеров, были синтезированы лабораторией синтетической биологии ИХБФМ СО РАН (Новосибирск). Для проведения обратной транскрипции в работе использовали олигонуклеотиды, представленные в таблице.
Для обратной транскрипции и амплификации кДНК использовали смесь для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени БиоМастер ОТ-ПЦР SYBR Blue (2×) («Биолабмикс», Россия). Реакцию проводили на амплификаторе Bio-Rad CFX 96 Touch в следующих условиях: обратная транскрипция при 45 °C — 30 мин, предварительная денатурация при 95 °C — 5 мин; в течение 40 циклов: денатурация 95 °С — 10 с, отжиг — 60 °С — 10 с, элонгация — 72 °С — 10 с. Каждая реакционная смесь объемом 15 мкл содержала до 40 нг исследуемой РНК, смесь БиоМастер ОТ-ПЦР SYBR Blue (2×) и 4,5 пмоль каждого праймера. Для нормирования использовали уровень экспрессии гена домашнего хозяйства B2M (микроглобулина бета-2).
Порог детекции (Cq) для каждой реакции определялся автоматически программой BioRad SFX Maestro. Относительная количественная оценка продуктов амплификации среди множества культур клеток по одному гену производилась с помощью метода 2(−∆∆Cq), где ∆∆Cq = (CqГена − CqВ2М) Интересующей культуры − (CqГена − CqВ2М) Референсной культуры, где референсная культура — клеточная культура, уровень экспрессии искомого гена которой был взят в качестве базового. В данной работе в качестве референсной культуры была взята культура аденокарциномы молочной железы MCF7.
Результаты
Анализ базы данных для выбора целевых генов
Поскольку семейство генов MAGE является многочисленным, важно было выбрать ряд генов для анализа экспрессии мРНК в клетках полученных первичных культур УМ. В нашей работе был проведен анализ базы данных полнотранскриптомного секвенирования образцов опухолей от 80 пациентов с УМ [17]. Доля образцов, имеющих отличную от нуля экспрессию генов, представлена на рисунке 1 а. Условно по уровню наблюдаемой экспрессии гены семейства MAGE можно разбить на 4 группы: экспрессия практически в 100% образцов, экспрессия в значительной части образцов — от 60 до 25%, экспрессия в некоторых образцах — менее 25% случаев и отсутствие экспрессии. Как можно увидеть, в 100% опухолевых образцов детектируется мРНК генов MAGE II типа: MAGE-D1, MAGE-D2, MAGED4В, MAGE-E1, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2 и некдина (NDN). В меньшем числе опухолевых образцов детектировалась мРНК генов MAGE-A8, MAGE-B17, MAGE-C3, MAGE-D4 и MAGE-E2. Доля опухолей, положительных по экспрессии других генов MAGE, в том числе MAGE-A3/6, была менее 10%. Можно заключить, что для УМ более характерна экспрессия генов MAGE II типа.
Далее, среди MAGE-положительных образцов был проведен анализ относительного уровня экспрессии белок-кодирующих генов MAGE, основанный на средних значениях TMM (trimmed meaning of mean values) (рис. 1 б). Среди положительных образцов уровень относительной экспрессии гена MAGE-D2 определяется как самый высокий. Выявить повышенный уровень экспрессии среди генов MAGE типа I не удалось. Тем не менее интересно было проанализировать уровень мРНК генов MAGE-A3/6 в полученных нами культурах клеток.
Таким образом, гены MAGE-A3/6 и MAGE-D2, относящиеся к разным типам генов семейства MAGE, были выбраны для анализа в клетках культур УМ человека.
Анализ экспрессии генов MAGE-A3/6 и MAGE-D2 в клетках персональных культур УМ человека
Исполь
Рис. 3. Относительный уровень экспрессии мРНК генов MAGE-A3/6 (а) и MAGE-D2 (б) в клетках культур глиобластом U87-MG, U251-MG, нейробластомы SH-SY5Y и меланомы кожи A375. Данные представлены как среднее значение экспрессии ± SD относительно клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF7
Fig. 3. Relative mRNA expression level of MAGE-A3/6 (а) and MAGE-D2 (б) genes in U87-MG and U251-MG glioblastoma cells, SH-SY5Y neuroblastoma cells, and A375 skin melanoma cells. Data are presented as mean expression value ± SD relative to human MCF7 breast adenocarcinoma cells
Таблица Последовательности олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров в реакции ПЦР
Table Sequences of oligonucleotides used as primers in the PCR reaction
Уровень экспрессии целевой мРНК в клетках гормон-зависимой аденокарциномы молочной железы MCF7 принимали за единицу. Можно видеть, что только в клетках uMel1 и uMel5 уровень мРНК MAGE-A3/6 был высоким: в клетках uMel1 экспрессия мРНК гена MAGE-A3/6 была в 7 раз выше, чем в клетках MCF7, а в клетках uMel5 — в 3 раза выше (рис. 2 а). В остальных культурах клеток уровень мРНК MAGE-A3/6 был крайне низким.
Анализ показал, что все культуры клеток УМ были MAGE-D2-положительными (рис. 2 б). Только в двух культурах клеток — uMel5 и uMel11 — уровень мРНК MAGE-D2 был низким. Дополнительно образование целевого ПЦР-продукта во всех экспериментальных образцах анализировали в 2% агарозном геле (рис. 2 в).
Анализ экспрессии генов MAGE-A3/6 и MAGE-D2 в клетках постоянных культур меланомы кожи, нейробластомы и глиобластомы человека
Для характеризации паттерна экспрессии генов MAGE-A3/6 и MAGE-D2 в клетках УМ человека был проведен анализ мРНК этих генов в культивируемых линиях глиобластом U87-MG и U251-MG, клеток нейробластомы SH-SY5Y и в клетках меланомы кожи А375 человека (рис. 3 а, б). Наибольший уровень мРНК MAGE-A3/6 был в клетках нейробластомы SH-SY5Y и превышал таковой в клетках MCF7 более чем в 500 раз. В клетках меланомы кожи А375 человека уровень мРНК MAGE-A3/6 был выше, чем в клетках MCF7, в 100 раз. Наименьший уровень мРНК MAGE-A3/6 был в клетках глиобластомы U87-MG. Таким образом, даже среди глиобластом наблюдается существенная гетерогенность в экспрессии мРНК MAGE-A3/6.
Анализ мРНК MAGE-D2 показал, что только клетки нейробластомы SH-SY5Y имели высокий уровень экспрессии этой мРНК (рис. 3 б).
Обсуждение
В настоящее время нет полной ясности о молекулярных механизмах контроля экспрессии генов MAGE, но показана значимость дифференциального метилирования повторов CpG в ДНК [18]. В большинстве здоровых тканей экспрессия раково-тестикулярных антигенов ингибируется метилированием промоторов этих генов, и только в процессе гаметогенеза происходит деметилирование [19]. В ранних работах по определению генов MAGE было показано, что мРНК MAGE-A1, MAGE-A2 и MAGE-A3 экспрессируются в клетках УМ из первичного опухолевого очага и из метастаза [20]. Позднее при проведении исследований на большей выборке первичных опухолей была показана низкая экспрессия генов MAGE при УМ [21]. Так, при иммуногистохимическом анализе 32 парафиновых срезов УМ было показано, что MAGE-A3/6 экспрессировался лишь в ∼25% опухолевых клетках с разным уровнем [21].
Поэтому авторы считали, что терапия УМ с помощью таргетных препаратов, нацеленных на раково-тестикулярные антигены будет, скорее всего, неэффективной. Несмотря на то что повышенная экспрессия мРНК MAGE-A3 характерна для разных типов опухолей, полученные в данном исследовании результаты и анализ баз данных транскриптомов образцов опухолей УМ также позволяют сделать вывод о том, что MAGE-A3/6 скорее не является характерным регулятором опухолевой прогрессии при УМ.
В работе R. Ravichandran и соавт. [10] было показано, что количество белков MAGE-A3/6, которые функционируют как репрессоры аутофагии, снижается в ответ на голодание или резкое снижение питательных веществ в результате деградации в протеосомах. Тем не менее, нацеливание противоопухолевых препаратов на MAGE-A3/6 может иметь терапевтические преимущества при лечении MAGEA3/6-положительных УМ. Например, исследованная нами культура клеток uMel1 ассоциирована с маркерами неблагоприятного прогноза, однако имеет потенциал для таргетной анти-MAGE-A3/6-терапии [2, 4].
В данной работе мы показали, что для всех исследуемых клеточных культур УМ человека характерна экспрессия мРНК MAGE-D2. Можно видеть, что уровень мРНК MAGE-D2 в культурах клеток увеальной меланомы uMel1, uMel4, uMel6, uMel7 и uMel9 значительно выше, чем в культивируемых линиях глиобластом U87-MG, U251-MG и меланоме кожи А375 (рис. 3 б). Этот результат хорошо соотносится со значениями уровня экспрессии MAGE-D2 в опухолях УМ из базы данных [17], где 100% исследованных образцов были MAGE-D2-положительными. Возможно, нацеливание на MAGE-D2 может быть специфичным для широкого спектра УМ, в отличие от глиом человека. Для подтверждения этой гипотезы необходимы дополнительные данные по уровню белка MAGE-D2 в клетках УМ, поскольку регуляция экспрессии на посттранскрипционном уровне может влиять на уровень белка в клетках. Сверхвысокий уровень мРНК MAGE-D2 в клетках нейробластомы SH-SY5Y позволяет предположить участие MAGE-D2 в этих клетках в формировании злокачественного фенотипа. Так, например, для меланомы кожи недавно было показано, что MAGE-D2 подавляет экспрессию рецепторов цитокина TRAIL и играет важную роль в защите меланомы от TRAIL-индуцированного апоптоза [22]. Возможно, подобные механизмы могут реализовываться и в клетках SH-SY5Y.
Заключение
Паттерн экспрессии генов MAGE-D2 и MAGE-A3/6 отличается для культур клеток УМ, глиом и нейробластомы SH-SY5Y. Для клеток УМ человека более характерна экспрессия мРНК MAGE-D2, чем MAGE-A3/6, что потенциально позволяет проводить нацеливание противоопухолевых препаратов на эту мишень. Тем не менее существование УМ с высоким уровнем мРНК MAGE-A3/6 также свидетельствует в пользу прогностического и терапевтического потенциала этого молекулярного маркера. Гиперэкспрессия мРНК MAGE-A3/6 нейробластомой SH-SY5Y может вносить вклад в формирование злокачественного фенотипа в этих клетках.
Информация об авторах
Софья Павловна Зверева, аспирант лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, zvereksonik@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-4368-5850
Мария Васильевна Жильникова, аспирант лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, m.zhilnikova@g.nsu.ru, https://orcid.org/0000-0002-8969-8198
Михаил Михайлович Бирюков, младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, аспирант НГУ, biryukov.mm@ya.ru, https://orcid.org/0000-0002-1945-0576
Мария Николаевна Балантаева, старший лаборант лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, студент НГУ, m.balantaeva@g.nsu.ru, https://orcid.org/0009-0001-2843-4690
Василий Викторович Атаманов , зав. 7-м офтальмологическим отделением ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Новосибирский филиал, научный сотрудник лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, mntk@bk.ru, https://orcid.org/0000-0002-4001-2108
Ольга Михайловна Станишевская, к.м.н., зав. 4-м офтальмологическим отделением ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Новосибирский филиал, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН; stanishevskaya.olya@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-4149-3767
Дмитрий Валерьевич Черных, к.м.н., зав. 5-м офтальмологическим отделением ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Новосибирский филиал, научный сотрудник Лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, nfmntk.dima@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-4565-8386
Наталья Викторовна Кононова, врач-офтальмолог 7-го офтальмологического отделения ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Новосибирский филиал, 22samsonova@mail.ru https://orcid.org/0009-0005-5238-3546
Ольга Александровна Коваль, д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН, старший преподаватель кафедры молекулярной биологии НГУ, o.koval@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0001-7788-2249
Information about the authors
Sof’ya P. Zvereva, PhD student at the Laboratory of Biotechnology of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian branch, Russian Academy of Sciences, zvereksonik@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-4368-5850
Mariya V. Zhilnikova, PhD Student at the Laboratory of Biotechnology of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, m.zhilnikova@g.nsu.ru, https://orcid. org/0000-0002-8969-8198
Mikhail M. Biryukov, Junior Researcher at the Laboratory of Biotechnology of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, PhD student of Novosibirsk State University, biryukov.mm@ya.ru, https://orcid.org/0000-0002-1945-0576
Mariya N. Balantaeva, Laboratory assistant at the Laboratory of Biotechnology of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Student of Novosibirsk State University, m.balantaeva@g.nsu.ru, https://orcid.org/0009-0001-2843-4690
Vasilii V. Atamanov, Head of the 7th ophthalmology department of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian branch, Russian Academy of Sciences, Researcher at the Laboratory of Biotechnology, mntk@bk.ru, https://orcid.org/0000-0002-4001-2108
Olga M. Stanishevskaya, PhD in Medicine, Ophthalmologist, Head of the 4th ophthalmology department, Senior Researcher at the Laboratory of Biotechnology of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk branch, stanishevskaya.olya@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-4149-3767
Dmitriy V. Chernykh, PhD in Medicine, Ophthalmologist, Head of the 5th ophthalmology department of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian branch, Russian Academy of Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Biotechnology of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk branch, nfmntk.dima@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-4565-8386
Natalya V. Kononova, Ophthalmologist of the 7th ophthalmology department of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian branch, Russian Academy of Sciences, 22samsonova@mail.ru, https://orcid.org/0009-0005-5238-3546
Olga A. Koval, Doctor of Science in Biology, Leading Researcher at the Laboratory of Biotechnology of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian branch, Russian Academy of Sciences, Senior Lecturer of the Department of Molecular Biology of Novosibirsk State University, o.koval@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0001-7788-2249
Вклад авторов в работу:
С.П. Зверева: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
М.В. Жильникова: сбор, анализ и обработка материала, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
М.М. Бирюков: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
М.Н. Балантаева: сбор, анализ и обработка материала, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
В.В. Атаманов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Д.В. Черных: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
О.М. Станишевская: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Н.В. Кононова: сбор, анализ и обработка материала, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
О.А. Коваль: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Authors’ contribution:
S.P. Zvereva: collection, analysis and processing of the material, statistical data processing, writing, final approval of the version to be published.
M.V. Zhilnikova: collection, analysis and processing of the material, final approval of the version to be published.
M.M. Biryukov: collection, analysis and processing of the material, statistical data processing, writing, final approval of the version to be published.
M.N. Balantaeva: collection, analysis and processing of the material, final approval of the version to be published.
V.V. Atamanov: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material, writing, final approval of the version to be published.
D.V. Chernykh: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.
O.S. Stanishevskaya: collection, analysis and processing of the material, final approval of the version to be published.
N.V. Kononova: collection, analysis and processing of the material, final approval of the version to be published.
O.A. Koval: significant contribution to the concept and design of the work, writing, editing, final approval of the version to be published.
Финансирование: Исследование было поддержано грантом Российского Научного Фонда № 23-14-00285 и реализовано в рамках государственного задания ИХБФМ СО РАН № 121030200173-6 (исследование культур клеток глиом и нейробластомы).
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
Funding: The study was supported by the grant of the Russian Science Foundation № 23-14-00285 and was realized within Russian state-funded project for ICBFM SB RAS № 121030200173-6 (research of glioma and neuroblastoma cell cultures).
Patient consent for publications: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: There is no conflict of interest.
Поступила: 23.04.2025
Переработана: 18.06.2025
Принята к печати: 22.07.2025
Originally received: 23.04.2025
Final revision: 18.06.2025
Accepted: 22.07.202
