Экспрессия про- и противовоспалительных факторов при фемтосекундном лазерном сопровождении факоэмульсификации на фоне применения различных нестероидных противовоспалительных средств

    Актуальность

     Белки, больше известные как интерлейкины (IL) и хемокины, выполняют разнообразные биологические функции и обеспечивают нормальное функционирование организма [14].

    Термин IL изначально был адресован белкам, сходным по своей структуре, которые секретируются определенными лейкоцитами (продуцирующими клетками) и воздействуют на различные клетки (клетки цели) [9, 10].

    Исследователями было показано изменение уровней провоспалительных цитокинов при механическом воздействии на различные клеточные культуры [15, 22, 18, 23]. Опосредованное механическое воздействие может быть оказано и при воздействии лазерного излучения из-за раздвижения тканей при фотодизрупции и коллатерального эффекта при образовании кавитационных пузырей газа.

    Некоторые цитокины и хемокины могут напрямую или через каскад биохимических реакций влиять на интраоперационное состояние диафрагмы радужки [20]. Оценка уровня цитокинов и корреляционных взаимосвязей концентрации различных цитокинов может помочь решить вопросы необходимости и адекватности применения той или иной терапии для профилактики возникновения воспалительной реакции и снижения рисков появления или активации триггеров миоза зрачка [7]. Понимание изменения уровней цитокинов при различных формах хирургии может предсказать развитие ранних или отдаленных послеоперационных осложнений и привести к правильному выбору медикаментозной терапии.

    Кроме того, в исследованиях Chen Н. и соавт. отмечено наличие дисбаланса в уровнях цитокинов, хемокинов и фактора роста опухоли в группе после проведенного фемтосекундного лазерного сопровождения (ФЛС) без применения нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) [8]. С введением НПВС в схему предоперационной подготовки выявлено статистически значимое снижение концентрации простагландинов. Результаты оценки цитокинового профиля не полностью раскрывают механизмы метаболического ответа, возникающие в ответ на ФЛС, что препятствует пониманию механизмов возникновения клинически значимого интраоперационного миоза, который может возникнуть даже на фоне применения инстилляций НПВС [13].

    Цель

    Сравнительный анализ уровня цитокинов после проведения ФЛС и перед стандартной ФЭ, выполненных на фоне предоперационной инстилляции различных НПВС.

    Материал и методы

    Исследование представляет собой рандомизированное проспективное одноцентровое исследование. Фон НПВС создавался путем 4-кратной инстилляции раствора индометацина 0,1% (Индоколлир) или однократной инстилляции раствора бромфенака 0,09% (Броксинак) за сутки и в день операции.

    Экспериментальное исследование образцов внутриглазной жидкости (ВГЖ) проводили на основе анализа концентрации цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α, TNF-β) с помощью программы Flowcytomix Pro 3.0 (eBioscience). Определение концентрации цитокинов выполняли мультиплексным количественным методом с использованием набора Human Th1/Th2 11plex BMS810FF (eBioscience) на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500.

    Образцы ВГЖ были получены у 24 пациентов после ФЛСФЭ в группах с применением препарата бромфенак (группа I, 12 глаз) и индометацин (группа II, 12 глаз) в предоперационной схеме инстилляций и перед ФЭ у групп сравнения (группа III и IV, соответственно 12 и 17 глаз) с аналогичной схемой предоперационной подготовки.

     Характеристика пациентов по половому и возрастному составу отображена в табл. 1. Статистически значимые различия по возрасту (p>0,05, F-критерий) и по полу (p>0,5, критерий χ² для таблицы 4х2) между группами отсутствовали.

    Во всех группах неразведенные образцы ВГЖ (70-100 мкл) были аспирированы с помощью шприца с канюлей 27G из передней камеры.

    В первой и второй группах забор ВГЖ производился через 10-15 минут после проведения ФЛС и перед проведением ФЭ. Доступ в переднюю камеру осуществляли через сформированный одноплоскостной разрез роговицы фемтосекундным лазером шириной 1,2 мм на 9 часах путем вскрытия его специализированным микрохирургическим шпателем.

    В третьей и четвертой группе доступ в переднюю камеру осуществлялся путем формирования парацентеза копьевидным микрохирургическим ножом 20G (Mani Inc., Япония) на 9 часах.

    Все образцы были собраны в стерильных условиях одним хирургом и были незамедлительно перелиты в стерильные пластиковые пробирки Эппендорфа обьемом 1,5 мл и помещены на хранение в холодильную камеру – 80°C до момента проведения анализа.

    Статистическая обработка данных выполнялась в программе StatPlus 6.2.2.0 (AnalystSoft Inc., США). Нормальность распределения определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий между группами определяли непараметрическими методами с помощью U-критерия Манна-Уитни. Корреляционную зависимость определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Оценку корреляционной зависимости проводили с помощью построения корреляционной сети с помощью программы Cytoscape 3.5.1 (США) и приложения к программе Metscape 3.1.3 с установлением порогов коэффициента корреляции >0,7 и >0,9 [16]. Тепловые карты совместно с кластерным анализом составляли в собственной программе на основе библиотеки Seaborn на языке программирования Python. Кластерный анализ проводили по методу ближайших соседей.

    По общепринятому определению узлами (node) сети называли цитокины, а наличие их взаимосвязи – ребрами (edge). Для сравнительного определения уровня активности узлов проводили подсчет коэффициента связей (k) (количество ребер) для каждого узла корреляционной сети без учета направления связи [6].

    Исследование одобрено этическим комитетом ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова».

    Результаты

    Проведенный анализ уровня цитокинов в разных группах показал увеличение показателя IL-6 в первой группе по сравнению с третьей группой, p<0,05 (табл. 2). При анализе IL-6 во второй группе по сравнению с 4 группой статистически значимых различий выявлено не было.

    Построение корреляционных сетей с установлением порога значения корреляционного коэффициента (средней и сильной зависимости) позволило выявить взаимосвязь исследуемых цитокинов после проведения ФЛС. При установлении значения порога коэффициента корреляции >0,7 обнаружено отсутствие корреляционной зависимости IL-6 по отношению к другим исследуемым цитокинам в группе I (kIL-6=0) по сравнению с группой II, где присутствует корреляционная зависимость IL-6 с IL-4 (kIL-6=1) (рис. 1, 2). В группах III и IV IL-6 полностью утрачивает взаимосвязь с установленным порогом корреляционного коэффициента >0,7 (kIL-6=0) (рис. 3, 4). Более того, в группах сравнения III и IV коэффициент связей (k) был одинаковым по всему ряду цитокинов.

     При увеличении порога до 0,9 визуализированы наиболее сильные корреляционные взаимосвязи. В группе I по сравнению с группой II провоспалительные цитокины IL-8, TNF имеют меньше корреляционных взаимосвязей с установленным порогом коэффициента. В группе I kIL-8=1, kTNF-α=4, kTNF-β=4 (рис. 5), в группе II kIL-8=7, kTNF-α=7, kTNF-β=7 (рис. 6). Причем IL-1β в обеих группах имеет одинаковый коэффициент связей (kIL-1β=1). Противовоспалительный IL-10 в группе I имеет более низкий коэффициент связей (kIL-10=5), чем в группе II (kIL-10=7).

    Тепловые карты визуализируют перераспределение взаимосвязей в различных группах, при этом кластерный анализ выявил более раннее включение IL-6 в иерархию распределения цитокинов в группе II по сравнению с группами I, III и IV (рис. 7).

    Обсуждение

    При обработке результатов исследования уровня цитокинов во ВГЖ приходится сталкиваться с определенными трудностями. В первую очередь это большой разброс данных и трудности в получении больших выборок. В такой ситуации статистическая обработка данных не позволяет достоверно сравнить группы исследованных пациентов и вынуждает некоторых авторов просто исключать крайние значения из статистической обработки [5]. Это подразумевает, что значительное отклонение концентрации IL в передней камере является артефактом. Значительный разброс данных, по-нашему мнению, может быть связан с ошибками в хранении материала (высыхание и или сублимация в пробах ВГЖ), в чрезмерной реакции системы цитокинов на вмешательство (высокая популяционная вариабельность ответа на хирургическую травму). Возможны еще какие-то неучтенные или неизвестные нам факторы. Тем не менее, нами замечено, что в случае повышения значений содержания цитокинов в передней камере оно происходит во всем ряду исследованных IL.

    Все исследованные субстанции разделяются по своим свойствам на провоспалительные – IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, TNF-β, противовоспалительные – IL-4, IL-10 и иммуномодулирующие – IL-1, IL-4, IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, которые при определенных условиях могут оказывать как про-, так и противовоспалительный эффект. Такое разделение цитокинов является довольно условным [14].

    Для понимания развития иммунологических реакций необходимо учитывать не только содержание отдельных цитокинов, но и их взаимосвязи.

    Было выявлено увеличение показателей, отражающих содержание IL-6 в группе I по сравнению с группой III (p<0,05), что подтверждает гипотезу увеличения воспалительной реакции в ответ на ФЛС в интраоперационном периоде. Кроме того, в группах I и II после ФЛС были единичные случаи резкого увеличения показателя IL-6, в то время когда остальные показатели IL в этих случаях определялись близкими по своему значению к медиане каждого IL.

    При оценке корреляционных сетей становится очевидным, что действие IL-6 и других провоспалительных факторов не удается полностью заблокировать применением НПВС. Кроме того, менее выраженные взаимосвязи присутствуют при применении препарата бромфенак, что свидетельствует о его высокой эффективности в снижении взаимной индукции цитокинов. Такая находка согласуется с данными некоторых исследований, в которых показано, что активация IL-6 частично происходит вне каскадов с участием простагландинов и может осуществляться при простом механическом раздражении клеток, особенно это характерно для фибробластов [9, 16, 24]. Кроме того, согласно коэффициенту связей корреляционной сети (k) IL-10 в группе I по сравнению с группой II обнаружено меньшее участие этого IL в исследуемой корреляционной сети, что может говорить о его низкой противовоспалительной активности по отношению к другим IL по сравнению с группой II. Согласно механизмам регуляции иммунологических реакций, такое обстоятельство может указывать на меньшую воспалительную активность. Низкая воспалительная реакция будет способствовать менее активному участию противовоспалительного фактора в участии нейтрализации воспалительных факторов.

    ФЛСФЭ вполне может быть источником механического раздражения при высвобождении лазерной энергии в области передней, задней камеры и хрусталика с прямым воздействием на клетки радужной оболочки или влиять опосредованно через биохимические реакции.

    Повышение концентрации IL-6 с наличием положительных корреляционных взаимосвязей с другими воспалительными медиаторами может служить триггером для активации всего каскада воспалительного ответа и может быть главной причиной интраоперационного миоза.

     В нашем исследовании мы обнаружили отсутствие влияния IL-6 на другие цитокины после проведения ФЛС. Тем не менее, это не исключает его влияния на другие провоспалительные факторы в метаболических каскадах. IL-6 считается одним из ключевых цитокинов и, в соответствии с общими свойствами провоспалительных цитокинов (TNF-α и цитокины группы IL-1), служит важным связующим звеном в развитии реакций острого воспаления, активации природных иммунных механизмов и основных метаболических изменений в организме [10]. Повышение концентрации данного цитокина наблюдается при травме, инфекциях, некоторых иммунных системных заболеваниях [11]. IL-6 участвует в патологических механизмах при развитии глаукомы, вторичной катаракты, диабетического макулярного отека, окклюзии центральной вены сетчатки [25]. В настоящее время многочисленные исследования сфокусированы на разработке целевой терапии, направленной на ингибирование или полное подавление действия IL-6 и его рецепторных структур [12]. В процессе интраокулярного воспаления IL-6 принимает участие в развитии неоваскуляризации, иммунного ответа, острого и хронического воспаления [1-4]. Тем не менее, не желателен эффект полного блокирования действия IL-6 из-за его мультимодальности и участия в нормальных процессах метаболической активности тканей, поэтому применение соответствующих ингибиторов IL-6 должно проводиться в случаях с ярко выраженной патологией или в группах с определенными показаниями [9].

    При анализе корреляционных сетей было выявлено перераспределение и снижение корреляционных параметров между цитокинами в группе с ФЛС по сравнению с группами без ФЛС, несмотря на хирургическое лазерное воздействие, что может подтверждать отсутствие индукции провоспалительных каскадов цитокинов фемтосекундным лазерным воздействием при наличии соответствующей медикаментозной предоперационной подготовки.

    При кластерном анализе цитокинового профиля в группах после проведенного ФЛС (группы I и II) выявлен сдвиг распределения цитокинов в сторону объединения провоспалительных цитокинов попарно или в комбинации трех факторов. Кроме того, происходит разгруппирование противовоспалительных цитокинов в более дальние ряды, что может говорить об отсроченном ингибирующем действии на воспалительные факторы.

    Причем, в группах сравнения, несмотря на наличие сильных корреляционных взаимосвязей цитокины провоспалительного ряда попарно распределены с противовоспалительными цитокинами, что может говорить о нормальном балансе при отсутствии воспалительного триггера (рис. 7).

     Проведенный анализ позволяет сделать вывод, что НПВС индометацин и бромфенак эффективно нейтрализуют выброс провоспалительных цитокинов и нивелируют дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами при ФЛСФЭ.

    Ограничения исследования. Наше исследование ограничивает малая выборка пациентов в связи с жесткими критериями отбора. Помимо этого, общий иммунный статус, не выявленные хронические заболевания, соматический статус, латентные заболевания, а также факторы внешней среды могут влиять на содержание цитокинов и хемокинов в различных биологических жидкостях [18]. Более того, не определены нормативные значения концентраций исследуемых цитокинов, характеризующие отсутствие патологического процесса для ВГЖ. Другое ограничение исследования связано с техникой самих хирургических операций, когда забор ВГЖ осуществляется на разных этапах хирургии, а именно в группах сравнения (III и IV группы) невозможно производить забор ВГЖ после проведения капсулорексиса из-за необходимости вводить в переднюю камеру вискоэластические препараты.

    Заключение

    Основные описанные цитокины имеют среднюю и сильную корреляционную взаимосвязь друг с другом и могут быть взаимосвязаны как напрямую между собой, так и опосредованно через другие узлы сети как при применении ФЛС, так и без ФЛС у пациентов с наличием катаракты. Применяемые НПВС в некоторых случаях могут быть неэффективны для нейтрализации активации IL-6. В частности, выявлено, что индометацин обладает наименьшей активностью в нейтрализации IL-6 и выключении его из корреляционной сети при установленном пороге коэффициента корреляции >0,7. Дальнейшие исследования необходимы для верификации полученных данных и разработки оптимальной терапии, направленной на ингибирование провоспалительных факторов.