Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в опухолевых клетках у пациентов с увеальной меланомой

    Увеальная меланома (УМ) – наиболее частая внутриглазная злокачественная опухоль среди взрослого населения; у детей и подростков отмечены единичные случаи ее развития [1]. Опухоль характеризуется выраженной злокачественностью и склонностью к раннему метастазированию, при этом основным органом-мишенью является печень (до 90%). Группы факторов, влияющих на прогноз УМ: клинические, патоморфологические и молекулярно-генетические [2]. За последние годы накоплен значительный опыт изучения различных аспектов патогенеза опухоли, включая генетические, иммунологические и эндокринологические [3, 4]. В ряде работ описана возможная роль гормонального статуса пациента в определении степени риска злокачественной трансформации меланоцитов и развития УМ. Например, беременность и сопутствующие ей гормональные и другие изменения могут влиять на функционирование органа зрения в целом и развитие УМ, в частности [5, 6].

    ЦЕЛЬ

    Изучение рецепторного статуса клеток увеальной меланомы к эстрогену (РЭ) и прогестерону (РП).

    Материал и методы

    Все пациенты с подозрением на наличие УМ по данным клинических и инструментальных методов исследования подписывали информированное согласие на проведение исследования. Критериями соответствия служили показания к проведению энуклеации пораженного глаза, а именно большие размеры опухоли (высота опухоли более 8 мм, диаметр основания более 15 мм), ее неблагоприятная локализация в цилиарном теле, наличие экстрабульбарного роста, вторичной болящей глаукомы. Все исследования проведены в стационаре отдела офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца. Исследование проводили в течение 2 лет (2014–2016 гг.). Материал для цитологического исследования получали методом отпечатка из энуклеированных глаз. У 2 больных была выполнена тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) на живом глазу в операционной в связи с необходимостью исключения метастатического поражения глаза (в анамнезе у одного больного зафиксирован рак прямой кишки).

    Наличие рецепторов РЭ и РП изучали с помощью метода иммуноцитохимии (ИЦХ). Метод основан на высокоспецифической реакции антиген-антитело при изучении гисто- и цитопрепаратов с целью идентификации и установления локализации в клетках разнообразных молекулярных структур и соединений: гормонов, ферментов, рецепторов поверхностных мембран, белков промежуточных филаментов.

    Выполняли рутинное цитологическое исследование для подтверждения диагноза, используя стандартную окраску Май-Грюнвальд с последующей окраской Азур-Эозин. На втором этапе выполняли метод ИЦХ для дифференцировки меланоцитарной природы опухоли, используя панель МАТ (все маркеры цитоплазматические): HMB 45 – маркер меланоцитарной дифференцировки, coctаil Melan – меланомо-ассоциированный маркер, S-100 – маркер нейрональной дифференцировки, виментин – белок промежуточных филаментов.

    Для изучения рецепторного статуса использовали антитела к РЭ и РП фирмы Dako (Дания). Для визуализации реакций применяли систему детекции Ultra VISION LP Пероксидаза Полимер и DAB плюс хромоген фирмы Thermo Fisher Scientific (США). Данная система детекции позволяет выявлять специфические мышиные IgG или кроличьи IgG антитела, связанные с антигеном в препарате. Локус, в котором находятся специфические антитела, выявляют с помощью универсального препарата вторых антител, конъюгированного с полимером, меченым ферментом, который выявляет мышиный или кроличий иммуноглобулины. Затем полимерный комплекс визуализируется с помощью соответствующей системы субстрат-хромоген. Оценку результатов проводили на световом микроскопе Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия), используя увеличение 200, 400 и 1000х.

    В работе изучали опухолевую ткань энуклеированных глаз с УМ, определяя экспрессию РЭ и РП по количеству и интенсивности окрашивания ядер опухолевых клеток. Оценку экспрессии РЭ и РП оценивали количественным методом по системе H-score. Система подсчета включает интенсивность иммуноцитохимической окраски, оцениваемую по 4-бальной шкале, и долю окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски в баллах: 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2 – умеренное, 3 – сильное, 4 – очень сильное окрашивание.

    В практической работе нами использовалась простая схема оценки степени выраженности маркера в собственной модификации: отрицательная реакция трактуется как полное отсутствие или экспрессия антигена менее чем в 5% опухолевых клеток, слабоположительная – при наличии в 6-25% клеток, умеренно-положительная – в 26-75%, выраженная – более чем в 75% клеток.

    Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием приложения Microsoft Excel 2010 и статистической программы Statistica 10.1 («StatSoft», США).

    Результаты и обсуждение

    Обследовано 22 больных (8 мужчин и 14 женщин) с УМ, среди которых одна беременная на сроке 18 недель и один больной с экстрабульбарным ростом опухоли. Возраст пациентов варьировал от 22 до 76 лет (54,3±2,2 года). Средняя высота опухоли по данным ультразвукового исследования составила 9,7±1,2 мм (2,5-16,5), диаметр основания опухоли – 15,3±2,8 мм (3,9-20,1).

    Цитологический диагноз УМ установлен у всех больных, включая 2-х срочных цитологических исследования на операционном столе. На основании ТИАБ исключили метастатическую опухоль и идентифицировали УМ, с последующей энуклеацией и гистологическим подтверждением. Гистологическое исследование материала подтвердило диагноз УМ у всех 22 больных, из них выявлены следующие гистологические типы: эпителиоидноклеточный (n=4), смешанноклеточный (n=11), веретеноклеточный (n=7).

    В 80% УМ наблюдали положительную экспрессию HMB 45 и coctаil Melan, что подтверждало меланоцитарную природу опухоли. Отмечали слабовыраженную реакцию на S100. Во всех случаях была ярко выраженная реакция на виментин, проявляющаяся четкой коричневой окраской цитоплазмы.

    Используя предложенную выше схему, мы получили отрицательный результат, так как во всех препаратах визуализировались единичные коричнево-окрашенные ядра опухолевых клеток. Данный результат свидетельствовал о том, что реакция прошла, но в количественном отношении не имела положительного результата. У беременной пациентки не отмечено положительного результата, хотя в препаратах просматривались единичные окрашенные ядра и коричневые конгломераты, что мы расценили как артефакты. Для контроля проведена реакция на РЭ и РП у больной с раком молочной железы (материал предоставлен из Московского НИИ онкологии им. П.А. Герцена), где четко визуализировалась ядерная реакция на прогестерон (+8 баллов).

    J.M. Seddon et al. [7] наблюдали пациентов с УМ, из них 5 беременных женщин, причем одну пациентку наблюдали в течение 2 беременностей с последующей энуклеацией и гистологическим анализом исследуемого материала. На основании выдвинутой гипотезы о гормональных особенностях пациентов с УМ авторы проанализировали 7 образцов опухолевой ткани УМ, включая один от беременной женщины на наличие РЭ. Согласно полученным данным, специфических РЭ в опухолевой ткани, как и статистически значимой разницы в продолжительности жизни мужчин и женщин не выявлено. В нашем исследовании при проведении иммуноцитохимического анализа 22 энуклеированных глаз с УМ ни в одном случае не выявлена экспрессия РП и РЭ.

    Аналогичные результаты привели R.J. Grosten et al. [8] на основании анализа данных исследования COMS (Collaborative Ocular Melanoma Study). В работе приведены данные иммуногистохимического анализа 14 энуклеированных глаз с опухолями больших размеров, проведенного для определения РЭ I типа. Авторы не обнаружили указанные рецепторы ни в одном из исследуемых образцов. J.A. Shields et al. [9] выполнили исследование энуклеированного материала у 16 беременных пациенток, средний возраст которых составил 30 лет, а период гестации – 6 месяцев. Согласно данным, опухоли не имели гистологических отличий от таковых в общей популяции, а РЭ и РП на опухолевых клетках УМ не выявлены. Среди пациентов, вошедших в настоящее исследование, была одна беременная женщина с УМ, однако при иммуноцитохимическом анализе удаленного глаза РЭ и РП выявлены не были. Представляет также интерес многоцентровое исследование, проведенное в девяти европейских странах по изучению влияния гормонального статуса на развитие УМ, опубликованное в статье T. Behrenset et al. [10], где представлены результаты опроса 292 пациентов (165 мужчин и 128 женщин) с УМ, а также 3198 здоровых лиц (2121 мужчина и 1077 женщин). Данных об ассоциации риска развития УМ с особенностями гормонального статуса, приемом гормональной терапии или оральных контрацептивов не получено.

    Заключение

    Впервые в Российской Федерации проведена оценка экспрессии эстрогена и прогестерона у пациентов с увеальной меланомой. На основании изучения образцов 22 больных положительной экспрессии указанных гормонов в опухолевой ткани не выявлено, что коррелирует с немногочисленными данными литературы. Поиск возможной взаимосвязи с рецепторами других белков, включая 17-оксипрогестерон, необходимо проводить с помощью широкого спектра антител. Для определения влияния беременности на течение увеальной меланомы необходимы дальнейшие исследования.