Рис. 1. Электронная микрофотография вертикального среза зоны лазерного вреза, полученная при стандартном алгоритме (увеличение ×200). Морфологическая картина характеризуется выраженными структурными нарушениями глубоких стромальных слоев с признаками расслоения коллагеновых волокон (А), в то время как зона интрастромальной диссекции на уровне формирования лоскута не демонстрирует значительных деформаций (В)
Fig. 1. Electron micrograph of a vertical section of the laser incision zone, obtained using a standard algorithm (200× magnification). The morphological picture is characterized by pronounced structural abnormalities of the deep stromal layers with signs of collagen fiber delamination (А), while the intrastromal dissection zone at the level of flap formation does not show significant deformations (В)
Рис. 2. Электронная микрофотография поверхности стромального ложа после применения стандартного алгоритма (увеличение ×100). Наблюдаются гетерогенные кратерообразные дефекты значительной глубины (стрелка), отсутствие соединительных «мостиков» между зонами воздействия, а также преимущественное сохранение гладкой архитектоники поверхности
Fig. 2. Electron micrograph of the stromal bed surface after application of the standard algorithm (100× magnification). Heterogeneous crater-like defects of significant depth are observed, along with the absence of connecting «bridges» between the treated areas, and the predominantly smooth surface architecture
Введение
Согласно оценкам Всемирной организации здравоохранения, распространенность аномалий рефракции затрагивает свыше 2,2 млрд человек в глобальных масштабах, что обусловливает ведущую роль рефракционной хирургии в качестве основного метода их коррекции [1–5]. Современный этап развития данной области характеризуется применением фемтосекундных лазерных систем, использование которых обеспечивает воспроизводимость высоких функциональных показателей и снижение частоты интра и послеоперационных осложнений [4, 6–9].
Ключевым фактором, определяющим успех операций по методике FemtoLASIK, является этап формирования роговичного лоскута, а именно: гладкость его поверхности, легкость отделения от стромального ложа, уровень интраоперационного комфорта пациента, напрямую связанный с продолжительностью процедуры, и минимизация интраоперационных осложнений [10–13].
Несмотря на активное внедрение в клиническую практику усовершенствованных ускоренных алгоритмов создания поверхностного лоскута, вытесняющих стандартные протоколы, их всестороннее изучение остается недостаточным, в частности, отсутствуют систематические сравнительные и морфологические исследования, подкрепленные данными микроскопического анализа.
Цель
Проведение электронной микроскопии стромальных интерфейсов, сформированных с применением низкоэнергетического фемтосекундного лазера по стандартному и ускоренному хирургическим алгоритмам, с последующим сравнительным морфологическим анализом полученных данных.
Материал и методы
Экспериментальная часть работы была выполнена на кадаверных глазах, из которых предварительно изготовили склерокорнеальные комплексы для последующего микроскопического анализа. Каждый комплекс фиксировался в искусственной передней камере и подвергался воздействию фемтосекундного лазера в двух различных режимах: стандартном (длительность формирования лоскута — 35 с) и ускоренном (длительность — 8 с). Оба алгоритма предполагали создание лоскута линейным методом диаметром 8,7 мм и толщиной 130 мкм при идентичных параметрах лазера: средней частоте импульсов 2 МГц, энергии в диапазоне 50–2500 нДж и длительности импульса 200–500 фс. С целью сохранения морфологии режущей зоны для последующего анализа подъем сформированного лоскута не производился.
После фемтодиссекции образцы фиксировали в 10% растворе формалина в течение 5 суток, после чего склерокорнеальные комплексы рассекали лезвием на фрагменты размером не более 7×7 мм, включающие зону вреза и стромальное ложе, для подготовки к сканирующей электронной микроскопии. Процедура подготовки включала поэтапную дегидратацию в растворах ацетона возрастающей концентрации (10, 20, 30, 50, 70, 90 и 100%, трехкратно) с экспозицией по 10 мин на каждом этапе и последующую сушку в условиях критической точки. Высушенные образцы монтировали на алюминиевые столики с применением токопроводящего клея, напыляли слоем золота толщиной 5 нм и исследовали на сканирующем электронном микроскопе JEOL 6000 PLUS (Jeol, Япония) в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 15 кВ. Анализ повреждений коллагеновых волокон и подсчет кратеров проводили при увеличениях от 20× до 1000× с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistica 10.0 (Dell Inc., США). Нормальность распределения изучаемых показателей оценивалась с помощью критерия Шапиро– Уилка. Поскольку распределение большинства переменных не подчинялось нормальному закону, для описания данных использовались медиана (Me) и интерквартильный размах в виде 25го и 75го процентилей (Q25; Q75). Сравнение независимых выборок (группа А и группа В) выполнялось с применением непараметрического Uкритерия Манна–Уитни. Статистически значимыми различия между группами считались при достижении уровня значимости p<0,05.
Рис. 3. Электронная микрофотография поверхности стромального ложа, полученная при стандартном алгоритме (увеличение ×100), с проведением морфометрического анализа поврежденных участков. В поле зрения наблюдается гетерогенное распределение кратероподобных дефектов различного диаметра
Fig. 3. Electron microscopy of the stromal bed surface (standard algorithm), 100× magnification, measurement of injured areas. Numerous «craters» of various sizes are visible.
Рис. 4. Электронная микрофотография вертикального среза зоны лазерного вреза, полученная при использовании ускоренного алгоритма (увеличение ×200). Наблюдается сохранение структурной целостности стромы с формированием гомогенной архитектоники без признаков волокнистой сепарации
Fig. 4. Electron micrograph of a vertical section of the laser incision zone, obtained using an accelerated algorithm (200× magnification). The structural integrity of the stroma is preserved with the formation of a homogeneous architecture without signs of fibrous separation
Результаты
При электронномикроскопическом исследовании зоны лазерного вреза, сформированного по стандартному алгоритму, были идентифицированы выраженные морфологические нарушения в глубоких слоях стромы, проявляющиеся ее расслоением, в то время как поверхностные отделы зоны вреза на уровне формирования лоскута сохранили структурную целостность без значительных деформаций (рис. 1).
После поднятия роговичного лоскута на поверхности стромального ложа визуализировались множественные неоднородные кратероподобные дефекты глубиной до 248 мкм, чередующиеся с участками сохранной стромальной архитектоники, что свидетельствует о неоднородном распределении энергии лазерного импульса. Отсутствие соединительных «мостиков» между зонами воздействия указывает на минимальное расстояние между соседними импульсами.
Следует отметить, что процедура отделения лоскута сопровождалась значительными трудностями, потребовавшими приложения повышенных механических усилий с выполнением раскачивающих движений шпателем (рис. 2, 3).
В свою очередь, микроскопический анализ образца, подвергнутого ускоренному алгоритму формирования роговичного лоскута, выявил сохранение целостности и непрерывности зоны лазерного вреза (рис. 4). После поднятия клапана наблюдалась характерная морфологическая картина с выраженной рыхлостью и пористостью стромальной поверхности, отличающаяся высокой степенью однородности и наличием многочисленных мелких пор. Присутствие соединительных «мостиков» между зонами воздействия указывает на увеличенное расстояние между соседними лазерными импульсами (рис. 5, 6). Процедура отделения роговичного лоскута в данном случае не сопровождалась техническими сложностями.
По итогу статистической обработки полученные данные можно представить в виде таблицы (таблица). Как видно из данных таблицы, значение анализируемого максимального размера кратеров, мкм, характеризующего состояние стромальной поверхности, в группе В было статистически значимо ниже, чем в группе А. В группе А медианное значение признака составило 65,1 ед., при этом 50% всех измерений находились в интервале от 45,8 до 147,0 ед. В группе В медианное значение было ниже и составило 51,0 ед., а интерквартильный размах — от 35,4 до 73,3 ед., что указывает не только на меньшие значения показателя, но и на меньший разброс данных вокруг медианы по сравнению с группой А. Статистический анализ с использованием Uкритерия Манна–Уитни подтвердил наличие значимых различий между исследуемыми группами (Z=2,1; p=0,039).
Помимо количественного анализа, был проведен анализ частоты встречаемости качественного признака — наличия крупных и глубоких дефектов типа «кратер» на поверхности стромального ложа, за которые принимались все случаи обнаружения «кратеров», превышающее значение 140 мкм. В группе А дефекты типа «кратер» были обнаружены у 5 из 19 образцов (26,3%).
В то же время в группе В подобные грубые нарушения поверхности были выявлены лишь в 1 случае из 23 (4,3%).
Таким образом, доля образцов с неблагоприятным морфологическим признаком («кратер») в группе со стандартным алгоритмом оказалась в 6,1 раза выше, чем в группе с ускоренным алгоритмом. Статистический анализ с использованием критерия χ2 Пирсона показал, что выявленные различия в частоте встречаемости «кратеров» между группами являются статистически значимыми: χ2=4,1; p=0,043 (рис. 7). Проведенный сравнительный анализ морфологических особенностей позволил установить значимые различия в ультраструктурной организации стромальных поверхностей роговицы после применения стандартного и ускоренного протоколов формирования роговичного лоскута с использованием низкоэнергетического фемтосекундного лазера. Основным ограничением настоящей работы является малый размер биологической выборки (один кадаверный глаз на группу), что обусловливает предварительный, пилотный характер полученных данных. Статистический анализ, проведенный на основе множественных морфологических дефектов, тем не менее, выявил статистически значимые различия в микроструктуре поверхности, что подтверждает наблюдаемый эффект.
Рис. 5. Электронная микрофотография поверхности стромального ложа после применения ускоренного алгоритма (увеличение ×100). Наблюдается морфологическая картина губчатой, пористой структуры стромы с наличием соединительных «мостиков» между зонами воздействия
Fig. 5. Electron micrograph of the stromal bed surface following the application of the accelerated algorithm (100× magnification). The morphological picture of a spongy, porous stromal structure with the presence of connecting «bridges» between the treatment zones is observed
Рис. 6. Электронная микрофотография поверхности стромального ложа при ускоренном алгоритме с проведением морфометрии поврежденных зон (увеличение ×100). Визуализируются многочисленные мелкие кратероподобные дефекты с незначительной глубиной, равномерно распределенные по стромальной поверхности
Fig. 6. Electron micrograph of the stromal bed surface using an accelerated algorithm with morphometric analysis of damaged areas (100× magnification). Numerous small, shallow, crater-like defects are visualized, uniformly distributed across the stromal surface
Полученные данные позволяют предположить, что ускоренный алгоритм может быть не только более быстрым, но и потенциально более щадящим для стромы, обеспечивая лучшую поверхность для последующей абляции и, возможно, более предсказуемое заживление.
Меньшая травматизация ткани и легкость отделения лоскута являются важными факторами для минимизации интраоперационных осложнений и достижения высоких функциональных результатов.
Для окончательного подтверждения этих выводов и установления прямой корреляции между морфологией и клиническими исходами необходимы дальнейшие исследования на большем количестве биологического материала, включая доклинические исследования на животных и последующие рандомизированные клинические исследования.
Выводы
Качество стромального ложа. Несмотря на наличие единичных «мостиков», указывающих на большее расстояние между лазерными импульсами, ускоренный алгоритм позволил получить более однородную и гладкую поверхность стромального ложа. Она характеризовалась распространенными, но мелкими и неглубокими «порами». В отличие от этого, стандартный алгоритм привел к формированию неоднородной поверхности с грубыми, глубокими и крупными «кратерами», что свидетельствует о более агрессивном и неравномерном воздействии на ткань.
Процесс отделения лоскута. Важным практическим результатом является легкость отделения роговичного лоскута после ускоренного алгоритма, в то время как при стандартном протоколе потребовались значительные физические усилия. Это прямо указывает на потенциальное преимущество ускоренного метода с точки зрения интраоперационного комфорта хирурга и, вероятно, снижения риска микроперфораций лоскута.
Состояние зоны вреза. Ускоренный алгоритм продемонстрировал лучшую сохранность глубоких стромальных слоев в зоне вреза, где не наблюдалось грубых расслоений и повреждений, выявленных при стандартном подходе.
На основании данных результатов можно предположить, что применение ускоренных алгоритмов фемтодиссекции в клинической практике не должно влиять на функциональные результаты операции.
Информация об авторах
Мисюрев Дмитрий Михайлович — врачофтальмолог, Тамбовский филиал ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н Федорова» Минздрава России, md110696@mail.ru, https://orcid.org/0009000597822717
Островский Дмитрий Сергеевич — к.б.н., зав. лабораторией трансплантологии и клеточной биологии Центра фундаментальных и прикладных медикобиологических проблем, ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н Федорова» Минздрава России, fgu@mntk.ru, https://orcid.org/0000000228177102
Фабрикантов Олег Львович — д.м.н., профессор, директор Тамбовского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н Федорова» Минздрава России; зав. кафедрой офтальмологии Института медицины и здоровьесбережения ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина», fabrmntk@yandex.ru, https://orcid.org/0000000300979910
Шутова Светлана Владимировна — к.б.н., научный сотрудник Tамбовского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России; доцент кафедры медицинской биологии ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина», shutova.tsu@yandex.ru, https://orcid.org/0000000249297787
Панкова Ирина Сергеевна — студентка ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина», pankovaschool@yandex.ru, https://orcid.org/0009000144040114
Нестерович Анастасия Сергеевна — студентка ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина», nesterovich.a_2004@mail.ru, https://orcid.org/0009000119201318
Рис. 7. График с распределением «кратеров» по размеру в исследуемых группах
Fig. 7. A chart showing the distribution of «craters» by size in the study groups
Таблица Сравнительный анализ размеров и частоты встречаемости «кратеров» в строме роговицы после формирования лоскута по стандартному и ускоренному алгоритмам
Table Comparative analysis of the sizes and frequency of occurrence of «craters» in the corneal stroma following flap formation using standard and accelerated algorithms
Information about the authors
Dmitry M. Misyuryov — ophthalmologist, the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Tambov branch, md110696@mail. ru, https://orcid.org/0009000597822717
Dmitry S. Ostrovsky — PhD, Head of the Laboratory of Transplantology and Cell Biology, Center for Fundamental and Applied Medical and Biological Problems, The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, fgu@mntk.ru, https://orcid.org/0000000228177102
Oleg L. Fabrikantov — MD, Professor, Director of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Tambov branch; Head of the Ophthalmology Department of the Institute of Medicine and Health Preservation of Tambov State University named after G.R. Derzhavin, fabrmntk@yandex.ru, https://orcid.org/0000000300979910
Svetlana V. Shutova — PhD, Researcher, the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Tambov branch; Associate Professor, Department of Medical Biology, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, shutova.tsu@yandex.ru, https://orcid.org/0000000249297787
Irina S. Pankova — student, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, pankovaschool@yandex.ru, https://orcid.org/0009000144040114
Anastasia S. Nesterovich — student, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, nesterovich.a_2004@mail.ru, https://orcid.org/0009000119201318
Вклад авторов:
Мисюрев Д.М. — сбор и обработка материала, статистическая обработка, написание текста.
Островский Д.С. — сбор и обрабокта материала, статистическая обработка.
Фабрикантов О.Л. — концепция и дизайн исследования, редактирование.
Шутова С.В. — статистическая обработка.
Панкова И.С. — сбор и обработка материала.
Нестерович А.С. — сбор и обработка материала.
Authors’ contribution:
Misyuryov D.M. — data collection and processing, statistical processing, writing.
Ostrovskiy D.S. — data collection and processing, statistical processing.
Fabrikantov O.L. — study concept and design, editing.
Shutova S.V. — statistical processing.
Pankova I.S. — data collection and processing.
Nesterovich A.S. — data collection and processing.
Финансирование: Исследование выполнено в рамках реализации программы развития ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» «Приоритет2030».
Source of funding: The research was carried out within Derzhavin Tambov State University development program «Priority2030».
Конфликт интересов: Отсутствует.
Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.
Поступила: 11.11.2025
Переработана: 24.12.2025
Принята к печати: 27.01.2026
Received: 11.11.2025
Revision: 24.12.2025
Accepted: 27.01.2026
