Электронно-микроскопическое исследование зрительного нерва с токсическим невритом в эксперименте

    Актуальность

    Для разработки лечебных мероприятий в офтальмологии принято использовать экспериментальные модели. Одной из них является модель токсического неврита зрительного нерва, развивающегося у экспериментальных животных при внутрибульбарном введении метилового спирта. Неврит (оптический или зрительный неврит) — это острое заболевание, проявляющееся выраженным воспалением зрительного нерва (ЗН), после которого наблюдается резкое снижение зрения, уменьшаются поля зрения, появляются центральные и парацентральные скотомы, а в исходе заболевания развивается полная его трофия [1, 2]. На фоне повреждения ЗН метанолом развивается так называемая токсическая оптическая нейропатия, механизм которой обуславливает блокаду митохондриального метаболизма сетчатки и ЗН с помощью муравьиной кислоты, которая является метаболитом данного спирта. Следует отметить, что снижение зрения (которое может исчезнуть через несколько часов или дней после приема метилового спирта) при отравлении связывают с патологическими изменениями митохондрий и окислительными процессами (а именно фосфорилирования). Особенности структурных изменений ЗН у пациентов при отравлении метанолом заключаются в истончении слоя нервных волокон сетчатки и последующем формировании микрокистозных изменений во внутренних слоях сетчатки. Также отмечаются повреждения наружных ее слоев, в частности, в области фоторецепторов [1, 3, 4].

    Морфологические изменения структурных элементов зрительного нерва, происходящие на тканевом уровне после отравления метанолом, довольно подробно описаны некоторыми исследователями [5]. Электронно-микроскопическое изучение интрабульбарной части зрительного нерва экспериментальных животных могло бы дополнить и углубить имеющиеся сведения по механизму развития данного вида нейропатий.

    Цель

    <Целью данного исследования было выявить ультраструктурные изменения зрительного нерва в области решетчатой пластинки у кроликов после воздействия метилового спирта.

    Материал и методы

    На 8 кроликах весом 2–2,5 кг породы Шиншилла была воспроизведена модель экспериментального неврита зрительного нерва с введением в ретробульбарное пространство метилового спирта (1,0 мл 10 % раствора) [1]. Животные выводились из опыта на 14, 30, 90 и 180-е сутки после воздействия метанола под тиопенталовым наркозом. Все процедуры проводили соответственно Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 «О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием «экспериментальных животных», соблюдали международные принципы Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным (2000 г.), а также Федеральный закон РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

    Энуклеированные глазные яблоки кроликов фиксировали в 10 % забуференном формалине по Лилли — 24 часа. Электронно-микроскопическому исследованию были подвергнуты небольшие кусочки (1–2 мм) зрительного нерва в области решетчатой пластинки. Фиксацию и заливку материала проводили стандартными методами. Кусочки тканей фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида на какодилатном буфере (рН 7,2– 7,4) с дофиксацией в 1 % растворе тетраоксида осмия (OsO4). Материал обезвоживали в батарее спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне, заливали в смолу эпон-812 и полимеризовали при температуре 37о С и 60о С в термостате. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-III 8800 (Швеция) и контрастировали 2 % водным раствором уранилацетата и цитратом свинца, изучали с помощью трансмиссионного микроскопа Jem-1011 (Jeol, Япония) при увеличении от 2000 до 20 000.

    Результаты

    На 14-е сутки после ретробульбарного введения метанола сетчатка глаз кроликов в области решетчатой пластинки имела признаки выраженного отека в виде набухания цитоплазмы ганглиозных нейронов, отека и просветления их многочисленных аксонов, формирующих далее зрительный нерв (рис. 1, А). Многочисленные в норме внутриклеточные органеллы в нейронах после отравления метанолом подвергались деструкции. Между набухшими нейронами выявлялись гипертрофированные глиальные клетки — Мюллеровские клиоциты.

    За решетчатой пластинкой большинство формирующих нерв аксонов ганглиозных клеток имели миелиновые оболочки. Вследствие отечности и деструкции органелл аксоны также имели оптически светлую аксоплазму.

    Митохондрии, нейрофиламенты и микротрубочки, характерные для аксонов, большей частью подвергались разрушению, лишь в некоторых нервных пучках органеллы частично продолжали определяться (рис. 1, Б). У отдельных нервных волокон миелиновые оболочки имели признаки деструкции в виде их расслоения и разволокнения. Определялся отек не только нервных волокон, но и астроцитов, особенно окружающих кровеносные сосуды. В таких глиоцитах разрушались все внутриклеточные органеллы. Набухшие концевые ножки астроцитов формировали светлые муфты вокруг спазмированных сосудов (рис. 1, В).

    Базальные мембраны вокруг стенки кровеносных сосудов заметно уплотнялись. В цитоплазме эндотелиальных клеток, формирующих сосудистые стенки, разрушались внутриклеточные органеллы, а внутри сосудов определялся гемостаз (рис. 1, Г). Выявленные морфологические изменения свидетельствовали о нарушении проницаемости гематоневрального барьера.

    В дальнейшем на 30-е сутки опыта дистрофические и деструктивные изменения цитоплазмы ганглиозных клеток и их отростков, формирующих зрительный нерв, а также окружающих глиоцитов, прогрессировали. В отдельных кровеносных сосудах продолжал определяться стаз кровяных элементов. Отек зрительного нерва далее на его протяжении постепенно заменялся картиной глыбчатого распада нервных волокон. У многих волокон зрительного нерва миелиновые оболочки подвергались структурным изменениям (рис. 2, А). Они сильно расслаивались, теряли конфигурацию правильной упаковки, а аксоплазма становилась мутной. Деструкция нервных волокон и их оболочек сопровождалась усилением глиомакрофагальной реакции (рис. 2, Б). В цитоплазме макрофагов, представленных микроглиоцитами, выявлялось большое количество гетерогенных фаголизосом, свидетельствующих об усилении их фагоцитарной функции.

    На 90-е сутки эксперимента вышеописанные морфологические признаки отека клеток и деструктивных процессов нервных волокон продолжали выявляться. Деструктивные процессы и глиофиброз сетчатки и нервных волокон зрительного нерва в зоне решетчатой пластинки усиливались по степени выражения вплоть до 180-х суток эксперимента (рис. 3, А).

    Определялись выраженные изменения в цитоплазме эндотелиальных клеток встречающихся кровеносных сосудов в виде набухания цитоплазмы и полной деструкции органелл (рис. 3, Б). Отдельные участки базальных мембран разрыхлялись и имели размытые нечеткие очертания. На ультратонких срезах продолжали выявляться признаки разволокнения и деструкции миелиновых оболочек волокон зрительного нерва, а также уплотнение, помутнение или, наоборот, просветление аксоплазмы нервных отростков (рис. 3, В). Рядом с такими разрушающимися участками и отечными отростками астроцитарных клеток закономерно определялись микроглиоциты с темными, несколько вытянутыми ядрами, с большим количеством фагосом и гетерогенных остаточных телец в цитоплазме (рис. 3, В). Они были как активные, так и истощенные. Последние подвергались апоптозу, о чем свидетельствовали характерные признаки в виде конденсации гетерохроматина, составляющие плотные фигуры на внутренней стороне кариолеммы, и фрагментации цитоплазмы (рис. 3, Г).

    Обсуждение

    Большинство исследователей считает, что главную роль в патогенезе оптического неврита, вне зависимости от причины возникновения, играют первичная активация нейроглии, избыточное образование ею и клетками иммунной системы провоспалительных цитокинов, нарушение микроциркуляции и внутрисосудистого гемостаза, повышение проницаемости гематоневрального барьера, а в случае запуска клеточно-опосредованных иммунопатологических реакций — проникновение в аксоны Т- и В-лимфоцитов и их сенсибилизация [6, 7].

    Опираясь на полученные нами результаты экспериментального исследования, можно предположить, что при интоксикации метиловым спиртом пусковым моментом развития зрительного неврита все же является нарушение микроциркуляции и повышение проницаемости гематоневрального барьера, влекущее затем за собой дистрофические и деструктивные изменения элементов нервной ткани. Последние события, как показали результаты нашего исследования, несомненно, ведут к активации макрофагов нервной ткани в лице микроглиоцитов.

    Макрофаги, вероятно, запускают в ход весь про- и противовоспалительный цитокиновый спектр, который в дальнейшем еще предстоит изучить иммуногистохимически.

    Другие глиальные клетки зрительного нерва — астроциты, обладая не только трофическими, опорными и защитными функциями, но и активно участвуя после гибели нейронов в компенсаторно-восстановительных реакциях нервной ткани, способствуют в конечном итоге глиофиброзу [5, 8–10]. В зоне сетчатки, переходящей в виде аксонов ганглиозных нейронов в волокна зрительного нерва, нами были обнаружены и признаки активации Мюллеровских глиоцитов сетчатки, также участвующих в этом процессе.

    Заключение

    Результаты электронно-микроскопических исследований интрабульбарной части зрительного нерва у экспериментальных животных в динамике после ретробульбарного введения метилового спирта указывают на то, что главным пусковым моментом развития зрительного неврита может являться нарушение процессов микроциркуляции в сетчатке и зрительном нерве, которое приводит к повышению проницаемости гематоневрального барьера. Указанные события влекут за собой дистрофические и деструктивные изменения нервной ткани, прогрессирование которых закономерно ведет при помощи глиальных клеток к глиофиброзу зрительного нерва.

    

    Информация об авторах

    Мусина Ляля Ахияровна — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа; morphoplant@mail.ru, orcid/ 0000-0003-1237-9284

    Лебедева Анна Ивановна — д-р биол. наук, старший научный сотрудник отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа; jeol102@mail.ru, orcid/ 0000-0002-9170-2600

    Корнилаева Гузэль Галеевна — д-р мед. наук, врач-офтальмохирург Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа; g.kornilaeva@alloplant.ru, orcid/ 0000-0002-1915-0311

    Гафаров Ильяс Зульфирович — врач-офтальмохирург Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, elias89@yandex.ru, orcid/ 0000-0003-4163-0765

    Корнилаева Маргарита Павловна — канд. мед наук, врач-офтальмохирург, зав. офтальмологическим отделением Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа; rita_k2004@mail.ru, orcid/ 0000-0003-1433-0206

    Information about the authors

    Lyalya А. Musina — Doct. of Sci. (Biol.), leading researcher of the Morphology Department Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa; morphoplant@mail. ru, https://orcid/ 0000-0003-1237-9284

    Anna I. Lebedeva — Doct. of Sci. (Biol.), leading researcher of the Morphology Department Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa; jeol102@mail. ru, https://orcid/ 0000-0002-9170-2600

    Guzel G. Kornilaeva — Doct. of Sci. (Med.), ophthalmic surgeon of the Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa; g.kornilaeva@alloplant.ru, https:// orcid/ 0000-0002-1915-0311

    Elias Z. Gafarov — ophthalmic surgeon of the Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa; elias89@yandex.ru, https://orcid/ 0000-0003-4163-0765

    Margarita P. Kornilaeva — Сand. medical sciences, ophthalmic surgeon, Head of Ophthalmological Department of the Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa; rita_k2004@mail.ru, https://orcid/ 0000-0003-1433-0206

    Вклад авторов

    Мусина Л.А. — существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, описание электронно-микроскопических препаратов, написание, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Лебедева А.И. — сбор, анализ и обработка материала, консультирование электронно-микроскопических препаратов, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Корнилаева Г.Г. — существенный вклад в концепцию и дизайн работы, хирургическое ведение эксперимента, сбор, анализ и обработка материала, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Гафаров И.З. — существенный вклад в концепцию и дизайн работы, хирургическое ведение эксперимента, сбор, анализ и обработка материала.

    Корнилаева Г.Г. — хирургическое ведение эксперимента, сбор, анализ и обработка материала.

    Authors’ contribution:

    Musina L.A. — significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, description of electron microscopic preparations, writing, editing, final approval of the version to be published.

    Lebedeva A.I. — collection, analysis and processing of the material, consultation of electron microscopic preparations, final approval of the version to be published.

    Kornilaeva G.G. — surgical management, collection, analysis and processing of material, writing, editing.

    Gafarov E.Z. — significant contribution to the concept and design of the work, surgical conduct of the experiment, collection, analysis and processing of the material.

    Kornilaeva M.P. — surgical conduct of the experiment, collection, analysis and processing of the material.

    Финансирование: авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Financial transparency: authors have no financial interest in the submitted materials or methods.

    Конфликт интересов: отсутствует.

    Conflict of interest: none.

    Поступила 13.04.2023 г.

    Переработана: 17.04.2023 г.

    Принята к печати: 21.04.2023 г.

    Originally received: 13.04.2023 г.

    Final revision: 17.04.2023 г.

    Accepted: 21.04.2023 г.