Актуальность
Рис. 1. ОКТ зоны фильтрационной подушки после НГСЭ: а) нефункциональная фильтрационная подушка; б) функциональная фильтрационная подушка (Anterior Segment OCT SS-1000 CASIA)
Fig. 1. OCT of the filtering bleb zone after NPDS: a) non-functional filtering bleb; б) functional filtering bleb (Anterior Segment OCT SS-1000 CASIA)
Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание конъюнктивы человека на подопланин с помощью первичных и вторичных антител, меченых Alexa Fluor 488 (зеленый) и ядер клеток (DAPI, синий); лазерная конфокальная микроскопия; 3D-реконструкции. Отдельная клетка с высокой экспрессией подопланина; рисунок обработан в режиме «поверхность» в программе Imaris® Bitplane 7.2.3
Fig. 2. Immunohistochemical staining of the human conjunctiva for podoplanin using primary and secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 488 (green) and cell nuclei (DAPI, blue); laser confocal microscopy; 3D reconstructions. A separate cell with a high expression of suboplanin; the drawing was processed in the «surface» mode in the Imaris ® Bitplane 7.2.3 program
Для адекватного формирования и длительного функционирования фильтрационной подушки необходимо соблюдение нескольких условий: 1) приток внутриглазной влаги в субконъюнктивальное пространство должен быть стабильным, 2) должна отсутствовать наружная фильтрация (в раннем послеоперационном периоде за счет недостаточной адаптации краев раны, в позднем – в результате кистозного перерождения и разрушения конъюнктивы); и 3) должна присутствовать равномерная абсорбция избыточного количества влаги, поступающей под конъюнктиву после фистулизирующей/фильтрующей хирургии глаукомы [6, 7].
Повышение эффективности антиглаукомных операций в настоящее время строится, в основном, на оптимизации первых двух требований. С этой целью широко используются различные искусственные дренажи и препараты, обладающие антифибротическим действием, такие как Митомицин-C и 5-фторурацил, которые неспецифически подавляют митоз, ограничивая тем самым фибробластическую активность и продукцию внеклеточного матрикса [8].
Несмотря на эти достижения и даже вопреки им хирурги все чаще сталкиваются с проблемой повышения ВГД в раннем послеоперационном периоде на фоне образования высоких, но ограниченных фильтрационных подушек. В этих случаях ретенция формируется на уровне оттока влаги из зоны фильтрационной подушки [9].
Механизмы оттока жидкости из фильтрационной подушки в субконъюнктивальное пространство изучены недостаточно. В связи с этим кажутся возможными два основных пути, наличие которых были показаны в отдельных исследованиях [10]. Это кровеносные сосуды, которые могут поглощать воду и, безусловно, в какой-то степени это делают и лимфатическая система конъюнктивы, которая берет на себя эту функцию после антиглаукомной хирургии.
Структурная и молекулярная оценка путей оттока влаги из фильтрационных подушек представляется актуальной и достаточно ценной в плане выявления патогенетических факторов их избыточного рубцевания, а также определения вектора лечебных и профилактических мероприятий, направленных на повышение и пролонгацию гипотензивного эффекта фистулизирующих операций при глаукоме.
Цель
Провести структурную и молекулярную оценку фильтрационных подушек у пациентов с ОУГ после НГСЭ по данным ОКТ, а также ультраструктурного и иммуногистохимического исследования.
Материал и методы
Проведено клиническое исследование 12 пациентов с ПОУГ, прооперированных методом НГСЭ, которым в качестве обязательного адъюванта через 21-45 дней была выполнена лазерная гониодесцеметопунктура. В отдаленном послеоперационном периоде оценивался достигнутый уровень ВГД, структура фильтрационных подушек оценивалась с помощью биомикроскопии и ОКТ переднего отрезка глаза (Anterior Segment OCT CASIA).
Для проведения иммуногистохимического тестирования были получены образцы конъюнктивы и субконъюнктивальной клетчатки путем хирургического иссечения части фильтрационных подушек. В 8 случаях (группа 1) это были нефункциональные рубцово измененные подушки, в 4-х случаях (группа 2) – функциональные, разлитые подушки, со значительным смещением на роговицу или темпоральную/назальную половину глазного яблока, что являлось причиной зрительного и косметического дискомфорта для пациентов.
Образцы фиксировали непосредственно после их получения в условиях операционной в 3,7 % параформальдегиде. Далее препараты иссекали косыми срезами на отдельные кусочки, трехкратно отмывали от транспортировочной среды и продолжали технологию иммуногистохимического окрашивания на экспрессию подопланина по отработанному нами протоколу.
• Блокирование неспецифичных антигенов блокирующим буфером (PBS + 0,3% Тритона Х100 + 1% бычьего сывороточного альбумина), 60 мин.
• Отмывка в PBS с 0,3% Тритона Х100, 5 мин – трехкратно.
• Инкубация с первичными антителами (Podoplanin Monoclonal Antibody (D2-40), species reactivity - human, host/isotype - mouse/IgG1; кат. MA1-83884), в разведении 1: 40 в растворе PBS с 0,3% Тритона Х100 (см. Табл. 1), +4 С - на ночь.
• Отмывка в PBS с 0,3% Тритона Х100, 5 мин – трехкратно;
• Инкубация со вторичными антителами (Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488; кат. A-11001), в разведени 1:1000 в растворе PBS с 0,3% Тритона Х100 (см. Табл. 1), 37 С, 1 ч;
• Отмывка в PBS, 5 мин – трехкратно;
• Окрашивание ядер с помощью DAPI, 15 мин;
• Отмывка в PBS, 5 мин – трехкратно;
• Помещение окрашенного образца на предметное стекло, заключение в заливочную среду ProLong Gold Antifade Mountant, запечатывание покровным стеклом.
Анализ полученных препаратов осуществлялся на лазерном конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss), лазеры: Track 1 - 405 nm: 3.0 %; Track 2 - 488 nm: 3.0 %. Все изображения, полученные с помощью данного микроскопа, обрабатывали с помощью двух программ: ZEN 2010 (Zeiss) и Imaris® Bitplane 7.2.3. В зависимости от поставленной задачи исследуемая ткань анализировалась послойно в виде 2D - срезов, объемных Z-стеков, или путем формирования ортогональных проекций выбранных участков.
Каждый образец был поделен на 4-7 кусочков. Образцы фиксировали в глутаральдегид-параформальдегиде, обезвоживали и помещали в смесь эпоксидной смолы для световой и электронной микроскопии. Образцы, внедренные в эпоксидную смолу, были полутонко срезаны, окрашены парафенилендиамином и исследованы с помощью фазово-контрастной световой микроскопии. Количественные измерения микроскопических размеров различных компонентов производились с помощью системы анализа изображений. Конкретные области интереса из этих образцов были выбраны для электронной микроскопии. Ультратонкие срезы окрашивали цитратом уранилацетата-свинца и исследовали с помощью электронного микроскопа (JEOL 100 B).
Статистический анализ
Результаты сравнительного анализа клинических характеристик пациентов рассчитывались с использованием таблицы критических значений статистики U-критерия Манна-Уитни [11].
Результаты
Рис. 3. Иммуногистохимическое окрашивание конъюнктивы человека на подопланин с помощью первичных и вторичных антител, меченых Alexa Fluor 488 (зеленый) и ядер клеток (DAPI, синий); лазерная конфокальная микроскопия; 3D-реконструкция. Участок лимфатического сосуда; высокое содержание подопланина (зеленый). Хорошо видны два ядра (синий) в стенке сосуда. На нижнем рисунке ядра клеток выделены в режиме «поверхность» в программе Imaris® Bitplane 7.2.3
Fig. 3. Immunohistochemical staining of the human conjunctiva for podoplanin using primary and secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 488 (green) and cell nuclei (DAPI, blue); laser confocal microscopy; 3D reconstruction. The area of the lymphatic vessel; high content of podoplanin (green). Two cores (blue) in the vessel wall are clearly visible. In the lower figure, the cell nuclei are highlighted in the "surface" mode in the Imaris ® Bitplane 7.2.3 program
Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание конъюнктивы человека на подопланин с помощью первичных и вторичных антител, меченых Alexa Fluor 488 (зеленый) и ядер клеток (DAPI, синий); лазерная конфокальная микроскопия; 3D-реконструкция. Лимфатический сосуд, в стенках которого содержится подопланин: а) продольный срез, б) поперечный срез. Подопланин выделен в режиме «поверхность» в программе Imaris® Bitplane 7.2.3
Fig. 4. Immunohistochemical staining of the human conjunctiva for podoplanin using primary and secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 488 (green) and cell nuclei (DAPI, blue); laser confocal microscopy; 3D reconstruction. The lymphatic vessel with the podoplanin in the walls: a) a longitudinal section, б) a transverse section. The podoplanin is selected in the «surface» mode in the Imaris ® Bitplane 7.2.3 program
При биомикроскопической оценке фильтрационных подушек у лиц первой группы в проекции зоны вмешательства конъюнктива частично или тотально была сращена с субэпителиальной тканью, в 3-х случаях отмечена избыточная васкуляризация, у 1-го пациента сформировалась кистовидная подушка, отграниченная подковообразным рубцом. По данным ОКТ – интрасклеральный канал не визуализировался, был щелевидным или слепо заканчивался по краю склерального лоскута, субэпителиальная ткань уплотнена (рис. 1 а), при формировании кистовидной подушки определялось куполообразное выпячивание конъюнктивы с подлежащей тенноновой оболочкой, полость арефлективна.
У пациентов второй группы фильтрационные подушки занимали большую площадь, диффузно распространялись по поверхности глазного яблока, превышая площадь склерального лоскута, с выраженным смещением на роговицу или боковые квадранты. Под конъюнктивой просвечивали свободные полости, подушки были гипо- или аваскулярны. По данным ОКТ интрасклеральный канал имел достаточное пространство, сообщающееся с рыхлой субконъюнктивальной клетчаткой. На срезе определялись множественные щелевидные пространства (рис. 1б).
Далее был проведен анализ результатов иммуногистохимического тестирования полученных образцов конъюнктивы. В образцах первой группы определялись единичные клетки с достаточным уровнем экспрессии подопланина (рис. 2). Сосуды, имеющие характеристики лимфатической системы, ни в одном случае выявлены не были. В то же время локально были обнаружены отдельные округлые образования, похожие на сферы, в стенках которых локализованы ядра и очень большое количество подопланина (рис. 3).
В каждом образце пациентов второй группы с функциональными фильтрационными подушками, напротив, определялось от 5 до 7 сосудов с различными вариантами экспрессии подопланина: 1 – равномерное распределение вдоль сосуда (рис. 4 а, б); 2 – подопланин экспрессируется локально – в отдельных участках сосуда (либо это связано с изгибами сосуда) (рис. 5).
Обсуждение
Рис. 5. Иммуногистохимическое окрашивание конъюнктивы человека на подопланин с помощью первичных и вторичных антител, меченых Alexa Fluor 488 (зеленый) и ядер клеток (DAPI, синий); лазерная конфокальная микроскопия; 2D-срез. Сосуд с участками локальной экспрессии подопланина (зеленый). Подопланин выделен в режиме «поверхность» в программе Imaris® Bitplane 7.2.3
Fig. 5. Immunohistochemical staining of the human conjunctiva for podoplanin using primary and secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 488 (green) and cell nuclei (DAPI, blue); laser confocal microscopy; 2D-section. A vessel with areas of local expression of podoplanin (green). The podoplanin is selected in the «surface» mode in the Imaris ® Bitplane 7.2.3 program
Таблица Клиническая характеристика пациентов
Table Clinical characteristics of patients
Механизмы дальнейшей абсорбции жидкости до сих пор изучены недостаточно. Эксперименты с инъекцией трассеров непосредственно в субконъюнктивальное пространство проводились в течение многих лет [14-18] в условиях прямой инъекции, в ходе или после хирургического лечения глаукомы. Полученные результаты позволили выдвинуть гипотезу и предположить, что полученные пути оттока являются лимфатическими. Основой этому служили данные, которые уже не могут подвергаться сомнению, о том, что существует субконъюнктивальная лимфатика [19, 20] и потому что лимфатика в человеческом организме должна выводить избыточную влагу из внеклеточного пространства.
В нормальных условиях артерии выделяют на 10–15% больше жидкости, чем может поглотить венозная система. В организме эта избыточная потеря жидкости улавливается лимфатической системой. Важным фактом для понимания полученных нами результатов является и то, что лимфатические сосуды могут разрушаться, если они длительно не выполняют свои функции. Лимфатическая система конъюнктивы представлена лимфатическим кругом Тейхмана, расположенным вдоль лимба в виде тонкого лимфатического сплетения и системой перпендикулярно расположенных радиальных сосудов, которые «стекают» к экватору глаза. Поверхностные лимфатические сосуды группируются между стриями Фогхта, чуть ниже расположены глубокие радиальные лимфатические сосуды. И те, и другие впадают в перикорнеальное лимфатическое кольцо, которое состоит из двух или более крупных коллекторных каналов, расположенных по окружности в 3 - 8 мм от лимба. Из перикорнеального лимфатического кольца лимфа стекает к задней части глаза по сосудам в верхнем, нижнем, медиальном и латеральном квадрантах [21].
Несмотря на эти данные, офтальмологическое сообщество до сих пор интуитивно не воспринимает и не обсуждает роль лимфатической системы глаза в патогенезе офтальмологических заболеваний с позиций нарушения, например, конъюнктивальной лимфатики. Хотя доказательство лимфатической идентичности путей оттока жидкости из субконъюнктивального пространства после фистулизирующих операций может играть ключевую роль в разработке методов лечения, направленных на оптимизацию процессов заживления и адекватного формирования вновь созданных путей оттока ВГЖ.
В предшествующих работах уже было показано, что поток трассировщиков из зоны фильтрационной подушки перемещается в лимфатические структуры [22]. Это важно для объяснения тех случаев, когда у пациента формируется большая фильтрационная подушка в виде однокамерной кисты, заполненной влагой, что подразумевает адекватный приток влаги из передней камеры глаза, но ВГД остается повышенным, потому что отток жидкости нарушен.
Результаты структурных и иммуногистохимических исследований, представленные в этой статье, однозначно свидетельствуют о том, что неудача фистулизирующей хирургии определяется в большей степени состоянием субконъюнктивальных путей оттока. По данным ОКТ субконъюнктивальное пространство уплотнено или же наоборот представлено в виде полости, не имеющей какого-либо матрикса. При этом в проекции нефункционирующих фильтрационных подушек полностью отсутствуют лимфатические сосуды, что имеет принципиальное отличие даже по сравнению с конъюнктивой здоровых людей [22]. Однако, в отдельных образцах были обнаружены сфероподобные образования, в стенках которых локализованы ядра и очень большое количество подопланина. Возможно, данные изображения демонстрируют первичные этапы морфогенеза лимфатических сосудов, либо их концевые участки – конусы роста, что может иметь прямое отношение к лимфангиогенезу [23, 24].
Иммуногистохимическое окрашивание образцов функциональных фильтрационных подушек на экспрессию подопланина, которое проводилось по отработанному нами протоколу, позволило визуализировать сеть сосудов, которые продемонстрировали наличие лимфатических маркеров в виде их равномерного распределения вдоль сосуда или локальной экспрессии на изгибах.
Установленная взаимосвязь между состоянием субконъюнктивальной клетчатки, изменениями лимфатического оттока, вероятно может оказывать решающее влияние на успех операции. Известно, что VEGF-C (C156S) [25], обнаруженный в переднем сегменте глаза и ретиноевая кислота (RA) способствуют лифоангиогенезу [26], а такие антифибротические препараты как Митомицин-С или 5-фторурацил токсичны для лимфатических узлов, неизбирательная электрокоагуляция, неизбежное пересечение лимфатических сосудов при проведении определенных этапов операции может вызвать серьезное повреждение лимфатических структур и в целом оказать негативное влияние на лимфоангиогенез [27].
В связи с этим возникают вопросы о целесообразности применения антиметаболитов в ходе операции и в послеоперационном периоде, о преимуществах и недостатках конъюнктивальных доступов «от лимба» или «от свода», о применении в послеоперационном периоде препаратов, стимулирующих восстановление лимфатических структур.
Заключение
Таким образом, результаты представленного исследования доказали, что отток избыточной влаги, поступающей в субконъюнктивальное пространство через вновь созданный путь оттока при хирургии глаукомы, осуществляется за счет конъюнктивальных лимфатических структур, состояние которых в определенной степени определяет успех или неуспех операции.
Необходимость дальнейшего изучения данной проблемы и разработки инструментов, позволяющих определённым образом влиять на лимфоангиогенез, не вызывает сомнения.
Вклад авторов в работу:
Т.Н. Юрьева: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Ю.В. Малышева: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.
И.В. Клименков: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала.
Н.П. Судаков: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала.
Authors contribution:
T.N. Iureva: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material, statistical data processing, writing of the text, editing, final approval of the version to be published.
Ju.V. Malysheva: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material, statistical data processing, writing of the text.
I.V. Klimenkov: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material.
N.P. Sudakov: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Авторство: Все авторы подтверждают, что они соответствуют действующим критериям авторства ICMJE.
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
ORCID ID: Малышева Ю.В. 0000-0002-4200-5649
Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial, or not-for-profit sectors.
Authorship: All authors confirm that they meet the current ICMJE authorship criteria.
Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: There is no conflict of interest.
ORCID ID: Malysheva J.V. 0000-0002-4200-5649
Поступила: 27.08.2021
Переработана: 31.08.2021
Принята к печати: 13.09.2021
Originally received: 27.08.2021
Final revision: 31.08.2021
Accepted: 13.09.2021
