Индукция каспазного каскада в условиях УФ-А-облучения роговицы в эксперименте

    Введение

    В настоящее время для лечения хронических кератэктазий широко применяется метод ультрафиолетового (УФ) кросслинкинга роговичного коллагена [1], при котором происходит повышение жесткости биомеханически нестабильной роговицы [2, 3].

    Одним из основных патогенетических факторов воздействия на роговицу в условиях выполнения данной хирургической процедуры является УФ-излучение диапазона А (длина волны 370 нм). Как известно, влияние УФ-излучения на орган зрения сопряжено с риском развития поражений эндотелия роговицы, нарушений прозрачности хрусталика, ухудшения функционального состояния пигментного эпителия сетчатки и др. В свою очередь, выраженность патологического воздействия ультрафиолета на глаз зависит от длины волны, мощности и продолжительности воздействия УФ-источника.

    Оценка влияния на интраокулярные структуры УФ-излучения в дозе, моделирующей технологию УФ-кросслинкинга роговичного коллагена, представляет значимый научный и практический интерес. Важным аспектом исследований при таком воздействии является изучение характера клеточной гибели в роговице (апоптоз, некроз) [4]. Как известно, процессы апоптоза или некроптоза могут реализовываться с участием сигнальных протеолитических ферментов каспаз, опосредующих один из путей гибели клеток. Показано, что последовательно развивающиеся процессы могут вызывать как апоптоз, так и некроптоз, в зависимости, соответственно, от наличия или отсутствия активности, в частности, каспазы-8 [5, 6]. К молекулярным маркерам каспазозависимого апоптоза относят также инициирующую каспазу-9 и эффекторную каспазу-3. [7]. Вызывает большой интерес модель УФ-А-облучения роговицы экспериментальных животных с длиной волны 370 нм, которая применяется для проведения хирургической процедуры УФ-кросслинкинга роговичного коллагена у пациентов с дегенеративными и воспалительными заболеваниями роговой оболочки глаза. Следует отметить, что УФ-кросслинкинг роговицы выполняется, как правило, с корнеальной деэпителизацией. В связи с этим еще одним важным аспектом для исследования является изучение влияния УФ-А-облучения на роговицу с удаленным эпителием.

     Цель.

    Оценить экспрессию факторов апоптоза каспазы-3, -8 и -9 кератоцитами после УФ-А-облучения роговицы крыс.

     Материал и методы.

    В исследование включено 10 беспородных крыс-самцов массой 200–240 г: 1-ю (контрольную) группу составили интактные животные (n=5), 2-ю (опытную) группу — крысы (n=5), которым проводили УФ-А-облучение деэпителизированной роговицы с длиной волны 370 нм, мощностью 3 мВт/см2 в течение 10 мин с инстилляциями физраствора из расчета 1 капля в минуту.

    Крыс содержали в пластиковых клетках при естественном освещении и комнатной температуре 22–24 ºС, кормили брикетированными комбикормами.

    Вода подавалась без ограничений. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с принципами, утвержденными Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (Приказ № 220 от 30.12.2016) и установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей) [8]. Спустя 14 и 30 суток животных выводили из эксперимента путем передозировки паров эфира, извлекали глазные яблоки, которые подвергали морфологическому исследованию.

    Гистологические методы исследования.

    Энуклеированные глазные яблоки фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, затем разрезали их вдоль сагиттальной оси от заднего наружного полюса орбиты до вершины роговицы. Каждый блок обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 (Германия), окрашивали гематоксилином и эозином.

    Для иммуногистохимических исследований парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond (Германия). В качестве первичных антител применяли: каспазу-3 (разведение 1:100), каспазу-8 (разведение 1:50) и каспазу-9 (разведение 1:200) (Affinity Biosciences, КНР). Для окрашивания использовали непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием микроскопа Leica DMD 108 (Германия) со специализированным программным обеспечением управления настройками, захвата изображения и морфометрии.

    Проводили подсчет доли позитивно окрашенных кератоцитов в основном веществе роговицы в полях зрения (n=20) для каждого животного при увеличении ×400 и выражали в процентах. Для проверки нормальности распределения изученных параметров использовались критерии Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Для оценки статистической значимости различий количественных показателей между исследуемыми выборками использовали U-критерий Манна–Уитни. Определяли медиану и квартили [Q25; Q75]. Результаты считали достоверными при уровне статистической значимости р<0,05. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием программного обеспечения Statistica 10.0.

    Результаты 

    С использованием иммуногистохимических методов исследования проводили оценку воздействия УФ-А-излучения на роговицу крыс на 14-е и 30-е сутки эксперимента посредством определения следующих факторов апоптоза: эффекторная каспаза-3, инициаторные каспазы-8 и -9 (рис.). Числовые данные количества искомых клеток в основном веществе роговицы представлены в таблице.

    В опытной группе содержание каспаза-3-иммунопозитивных кератоцитов роговицы на 14-е сутки незначительно изменилось — с 2% [2%; 3%] до 2,7% [2,6%; 2,9%] по сравнению с контрольными значениями, однако отличия были недостоверны (р=0,5). В последующем на 14–30-е сутки численность данных клеток практически не изменялась. Показатели в интактной и опытной группах на 30 суток наблюдений также достоверно не различались друг от друга (р=1,0).

    Содержание каспаза-8+-клеток спустя 14 суток после УФ-А-воздействия достоверно повысилось — до 11,4% [8,8%; 12,7%] относительно показателей контроля (р=0,0002). На 30-е сутки эксперимента по сравнению с 14-ми сутками наблюдали снижение численности иммунопозитивных кератоцитов (р=0,0002) до уровня значений интактных животных. В свою очередь, разницы в результатах между интактной и опытной группами (30 суток после УФ-облучения) выявлено не было (р=0,87).

    На 14-е сутки исследований было зафиксировано статистически значимое увеличение каспаза-9+ клеток по сравнению с контрольной группой: с 67% [66%; 68%] до 95% [90%; 97%] (р=0,0002). По прошествии времени (30 суток) численность каспаза-9+-клеток снизилась до 79% [78%; 80%], превышая при этом значения интактной группы на 12% с достоверностью различий р=0,0002.

    Обсуждение

    Апоптоз клеток является частью нормального развития многоклеточного организма, а также может быть запущен экзогенными воздействиями и эндогенными (внутриклеточными) факторами [9].

    Одним из вариантов апоптоза является индукция каспазозависимого пути клеточной гибели. Каспазы — это семейство протеолитических ферментов, играющих важную роль в процессе апоптоза. В свою очередь, апоптотическое подсемейство каспаз включает две подгруппы, называемые как инициаторные/апикальные и эффекторно-исполнительные каспазы. Апоптотические стимулы запускают активацию инициаторных каспаз (каспазы-2, -8, -9 и -10), которые затем расщепляют и тем самым активируют эффекторные члены (каспазы-3, -6 и -7). Последние, в свою очередь, нацеливаются на белки, содержащие последовательности аминокислот Asp-Glu-Val-Asp (DEVD), и расщепляют их [10]. Каспаза-3 относится к семейству цистеин-аспартатных протеаз (цистеиновых протеаз), наиболее известных своей способностью опосредовать расщепление специфических белков-мишеней [11, 12]. Каспаза-3 повсеместно экспрессируется в нормальных тканях, но на разных уровнях. Например, ассоциированный со старением эпигенетический механизм регуляции экспрессии каспазы-3 был выведен из данных о том, что количество транскриптов каспазы-3 снижено в тканях мозга пожилых крыс по сравнению с молодыми. Это подавление транскрипции в тканях пожилых крыс связано с возрастным увеличением метилирования ДНК и снижением ацетилирования гистона 4 промотора каспазы-3 [13].

    Внеклеточное связывание лиганда с одним из этих рецепторов смерти приводит к связыванию каспазы-8 с адаптерным белком Fas-ассоциированного домена смерти (FADD), образуя, таким образом, сигнальный комплекс, индуцирующий смерть клетки (DISC). Привлечение каспазы-8 к DISC облегчает ее олигомеризацию и активацию посредством саморасщепления. Расщепленная каспаза-8 затем индуцирует активацию нижестоящих эффекторных каспаз, активность которых впоследствии приводит к финальным стадиям апоптотической гибели клетки [10].

    Внутренний, или митохондриальный путь, ведущий к апоптозу, может быть инициирован различными стимулами, включая вирусные инфекции, гипоксию, гипертермию, окислительный стресс и внутренние стрессовые сигналы, возникающие в результате воздействия токсичных химических веществ или радиации, как это происходит, например, у онкологических пациентов, получающих химиотерапию или радиотерапию [10]. Следствием таких проапоптотических клеточных стрессоров является проницаемость наружной мембраны митохондрий и высвобождение апоптогенных факторов, таких как цитохром C из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль. Впоследствии образуется апоптосомный комплекс (содержащий цитохром c/Apaf-1/ каспазу-9), который затем запускает активацию эффекторных каспаз, включая каспазу-3 [10].

    Аналогичным образом, снижение воздействия на многие типы клеток определенных внешних факторов роста, цитокинов, гормонов или межклеточных взаимодействий, от которых зависит их жизнеспособность, также может активировать внутренний путь апоптоза, тем самым выявляя важную роль, которую эти внешние факторы обычно играют в блокировании дефолтной активации механизма апоптотического ответа [11]. Если рассматривать использованную нами в эксперименте модель УФ-А-облучения роговицы (370 нм), то факторами, индуцирующими процессы апоптоза кератоцитов, могут быть, как деэпителизация роговой оболочки, сопровождающаяся локальным выбросом провоспалительных цитокинов (в частности, фактор некроза опухоли-α), так и непосредственно цитотоксичные дозы УФ-воздействия [14]. Причем по данным ряда биофизических и морфологических исследований наибольшая доза ультрафиолета приходится на переднюю строму роговицы, тогда как средняя и задняя строма остаются более защищенными, вследствие рассеяния УФ-излучения.

    В данном исследовании кератоциты собственного вещества в интактной и опытной группах не имели статистически значимых различий между собой по числу каспаза-3+-клеток. Возможно, каспаза-3 в условиях использованной нами патологической модели УФ-воздействия не является маркером эффекторного апоптоза, т.к. известно о неапоптотическом действии фермента. Показано, что активность каспазы-3 может влиять на выживаемость, пролиферацию и дифференцировку как нормальных, так и злокачественных клеток и тканей, помимо ее собственной функции успешного организатора клеточной смерти [15]. Сопоставляя наши собственные исследования и данные литературы, можно заключить, что участие каспазы-3 в моделировании и поддержании жизнедеятельности тканей у млекопитающих, зависит от совокупности факторов, определяющих исходное фоновое состояние (гомеостаза) организма, специфичность и интенсивность экзогенного воздействия [16]. Каспаза-8 опосредует внешний, а каспаза-9 инициирует внутренний путь апоптоза. Каспаза 8 — регуляторный белок, цитозольная протеаза, основная и наиболее изученная функция которого — участие в апоптозе. Каспаза-8 участвует в митохондриальном и мембранном пути индукции апоптоза. Эта протеаза не только запускает каскад с участием эффекторных каспаз, в частности каспазы-3, но и взаимодействует с регуляторными белками, такими как cFLIP и RIPK1, модулируя баланс между выживанием клеток и апоптозом [17, 18].

    Динамика численности каспаза-8+-клеток на 14-е сутки в опытной группе демонстрировала достоверное повышение по сравнению с контролем. Спустя 30 сут количество каспаза-8+-кератоцитов соответствовало значениям интактных животных.

    Анализ содержания каспаза-9+-клеток в строме роговицы показал иную картину. В опытной группе через 14 суток уровень искомых клеток был достоверно повышен по сравнению с интактной группой. После чего (через 30 суток) численность клеток приближалась к значениям нормы.

    Как известно, каспаза-9 играет ключевую роль во внутреннем (митохондриальном) пути апоптоза, который запускается в ответ на апоптотические стимулы. Каспаза-9 активируется в ответ на высвобождение цитохрома С из митохондрий после чего становится способной к расщеплению и активации эффекторных каспаз (в частности, каспазы-3), что приводит к апоптозу. L.A. Sitailo и соавт. выявили in vitro активацию каспазы-9 в процессе апоптоза кератиноцитов эпидермиса человека, индуцированного ультрафиолетом, из которого ¾ составлял УФ-В-диапазон (доза облучения: 30 мДж/см2 — 1 мин). Авторы оценивают каспазу-9 как критически важную каспазу, инициирующую апоптоз под влиянием УФ-излучения. По мнению исследователей, активация каспазы-9 является основным фактором, определяющим апоптоз кератиноцитов, вызванный УФ-воздействием, и указывает на потенциальную положительную обратную связь между каспазой-3 и каспазой-8 [19].

    Вместе с тем в другом исследовании анализ мышиных клеток тимической лимфомы 3SB, подвергшихся воздействию УФ-излучения, показал быстрое высвобождение цитохрома С и активацию каспазы-3, при этом каспаза-9 оставалась неактивной. Кроме этого, в УФ-облученных клетках определяли активацию каспазы-8 и одного из медиаторов, опосредующих высвобождение цитохрома С из митохондрий [20].

    Известно, что УФ-А-лучи не разрушают ДНК клетки напрямую, как это делают УФ-В-лучи, но могут генерировать высокореактивные свободные кислородные радикалы, которые способны разрушать клеточную мембрану и негативным образом воздействовать на генетический аппарат клетки. По всей видимости, активность апоптотических каспаз связана с особенностями УФ-воздействия на клетки, такими как длина волны, флюенс излучения (время облучения, плотность потока энергии ультрафиолета) и, по всей видимости, циточувствительность по отношению к патогенетическому влиянию УФ-излучения.

    Заключение. 

    Проведенные исследования показали, что УФ-А-облучение деэпителизированной роговицы крыс длиной волны 370 нм (3 мВт/см2, 10 мин) способствовало увеличению количества позитивных кератоцитов, чувствительных к каспазе-8 и -9, опосредующих внешний и внутренний пути апоптоза. Численность каспаза-3+-кератоцитов оставалась без изменений. Оценка выраженности и патогенетические последствия клеточной гибели в роговице после ее УФ-А-облучения требуют дальнейших экспериментальных наблюдений.

    Информация об авторах

    Бикбов Мухаррам Мухтарамович — д.м.н., проф., директор Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Халимов Азат Рашидович — д.б.н., зав. научно-инновационным отделом Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Шевчук Наталья Евгеньевна — д.б.н., зам. директора по науке Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, ufaeyenauka@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-8475-531x

    Лебедева Анна Ивановна — д.б.н., зав. отделом морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Мусина Ляля Ахияровна — д.б.н., в.н.с. отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, morphoplant@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Валишин Искандер Дамирович — врач-офтальмолог 1-го офтальмологического отделения Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, iskander0796@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-1811-9320

    Information about the authors

    Mukharram М. Bikbov — Dr. of Med. Sci., prof., director, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Azat R. Khalimov — Dr. of Biol. Sci., head of the scientific and innovative department, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Natalya E. Shevchuk — Dr. of Biol. Sci., deputy director for science, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, ufaeyenauka@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8475-531x

    Anna I. Lebedeva — Dr. of Biol. Sci., head of the morphology department, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Lyalya A. Musina — Dr. of Biol. Sci., senior researcher at the morphology department, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, morphoplant@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Iskander D. Valishin — ophthalmologist of the 1st ophthalmology department, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, iskander0796@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-1811-9320

    Вклад авторов:

    Бикбов М.М. — концепция исследования, редактирование.

    Халимов А.Р. — сбор и обработка материала, концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование.

    Шевчук Н.Е. — редактирование.

    Лебедева А.И. — сбор и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Мусина Л.А. — сбор и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Валишин И.Д. — сбор и обработка материала.

    Authors’ contribution:

    Bikbov M.M. — concept of the study, editing.

    Khalimov A.R. — collection and processing of the material, concept and design of the study, writing, editing.

    Shevchuk N.E. — editing.

    Lebedeva A.I. — collection and processing of the material, writing, editing.

    Musina L.A. — collection and processing of the material, writing, editing.

    Valishin I.D. — collection and processing of the material.

    Финансирование. Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда № 24-25-00132, (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Financing. The work was funded by the Grant of the Russian Science Foundation No. 24-25-00132, (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Conflict of interest: None.

    Поступила: 27.10.2025

    Переработана: 12.11.2025

    Принята к печати: 19.11.2025

    Received: 27.11.2025

    Revision: 12.11.2025

    Accepted: 19.11.2025