Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента в составе кальций-фосфатных наночастиц как перспективные препараты для снижения внутриглазного давления

     В терапии глаукомы актуален поиск эффективных препаратов, влияющих не только на снижение ВГД, но и улучшающих кровоток глаза и функционирование сетчатки. Согласно литературным данным, а также результатам наших исследований, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ) могут значимо снижать ВГД, оказывать благоприятное воздействие на регионарный кровоток и гидродинамику глаза, а также функционирование нервных клеток сетчатки, то есть на основные звенья патогенеза глаукомы [1]. Стоит отметить, что доставка лекарственных веществ во внутренние структуры глаза сопряжена со многими трудностями. Подсчитано, что при инстилляциях только около 5-10% введенного лекарственного вещества проникает в переднюю камеру глаза. Это заставляет использовать препараты в высокой концентрации, что усиливает вероятность побочных эффектов и повышает стоимость лечения.

    Использование нанотехнологий в значительной степени позволит решить многие проблемы доставки лекарственных препаратов в глаз. Преимуществами включения глазных лекарственных препаратов в наночастицы является увеличение биодоступности и пролонгация действия препарата. Это позволяет снизить дозу лекарственного препарата, частоту его введения и, следовательно, снизить как местные, так и общие побочные реакции. В офтальмологии особенно актуальна и перспективна разработка глазных лекарственных форм на основе нанотехнологий в связи с трудностью доставки лекарственных веществ в различные отделы глаза.

    Современные нанотехнологии предлагают различные виды наноносителей для увеличения как биодоступности глазных лекарственных препаратов, так и времени пребывания их на поверхности глаза [2]. Наночастицы с внедренными лекарственными препаратами при инстилляциях в глаз могут лучше проникать через тканевые барьеры, а в некоторых случаях и продолжительное время оставаться на поверхности глаза в конъюнктиве или роговице и/или находиться в слезной пленке, постепенно высвобождая лекарственную субстанцию, тем самым пролонгируя действие препарата [3]. Лекарственные препараты в простых растворах проникают в ткани путем простой диффузии, скорость которой зависит от физико-химических свойств субстанции. Наночастицы проходят тканевые барьеры прежде всего за счет поступления в клетку путем эндоцитоза и последующего выхода из нее – экзоцитоза. Поглощенные вещества в клетке поступают в лизосомы, в которых они могут накапливаться или выводиться из них в переработанном виде [10].

    К носителям, обладающими такими свойствами, относятся неорганические кальций-фосфатные наночастицы (КФЧ). Компоненты их – кальций и фосфат – присутствуют в организме, например, в составе костной ткани, поэтому они биосовместимы, неиммуногенны, не токсичны и биодеградируемы [5]. Задачей настоящей работы явилось включение в КФЧ-соединений, обладающих способностью снижать ВГД, различной природы – ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента эналаприлата, лизиноприла и β-блокатора тимолола, а также характеристика полученных частиц и выяснение возможности усиления биологического действия выбранных препаратов при включении их в наночастицы.

    Цель

    Выяснить возможность применения ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ) в составе кальций-фосфатных наночастиц (КФЧ) для снижения внутриглазного давления (ВГД).

    Материал и методы

    Получение КФЧ.

    Кальций-фосфатные наночастицы были синтезированы по методике [11] из раствора K2HPO4, цитрата Na и CaCl2 в соотношении 5:1:5 с помощью ультразвукового гомогенизатора (Bandelin Sonopuls, Германия) [12]. Полученные частицы хранили при 4°C.

    Включение эналаприлата в КФЧ производили на стадии получения частиц. Эналаприлат вносили в раствор K2HPO4. Конечная концентрация эналаприлата в растворе составила 7,7 мМ. Далее производили покрытие частиц 5 kDa хитозаном или гликоль-хитозаном по методике Kanwar [14]. Оценку эффективности включения лизиноприла в КФЧ проводили путем отделения частиц, содержащих включенные препараты, от раствора фильтрацией через мембраны Microcon 30 kDa и 100 kDa соответственно в процессе центрифугирования при 7000 g и определения лизиноприла в фильтратах.

    Оценку эффективности внедрения эналаприлата в КФЧ проводили концентрированием путем фильтрации во время центрифугирования при 5400 g в течение 5 минут. Затем определяли активность эналаприлата в растворе, прошедшем через мембрану, с Cbz-Phe-His-Leu в качестве субстрата [15].

    Концентрацию лизиноприла определяли по модифицированной методике [15], основанной на реакции взаимодействия свободной аминогруппы ингибитора с ортофталевым альдегидом и N-ацетил-L-цистеином с образованием хромофорного соединения с максимумом поглощения при λmax=340 нм.

    Для внедрения тимолола в КФЧ полученные частицы «покрывали» целлобиозой путем добавления к взвеси сконцентрированных частиц ее раствора («Merck», Германия) до 0,5%-го при медленном перемешивании.

    Оптическую плотность хромофорных соединений определяли на фотометре для микропланшетов Tecan Infinite® M200 (Швейцария).

    Эксперименты in vivo проводили на кроликах породы шиншилла массой 2-2,5 кг. Все эксперименты выполняли в соответствии с рекомендациями Association for research in Vision and Ophthalmology (ARVO) для проведения исследований на животных, а также с требованиями Комитета по этике НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца. Сравнительную оценку действия лизиноприла, энаприлата и тимолола в составе КФЧ проводили путем определения их влияния на ВГД у кроликов.

     В экспериментах с лизиноприлом, энаприлатом и тимололом было задействовано 15 кроликов, которые были случайным образом разделены на 3 группы.

    Первой и второй группе с лизиноприлом в оба глаза проводили однократное закапывание 40 мкл 1,5%-го раствора лизиноприла и 40 мкл суспензии 1,5%-го лизиноприла в КФЧ соответственно.

    Первой и второй группе с энаприлатом в оба глаза однократно закапывали 40 мкл 0,125%-го раствора энаприлата и 40 мкл суспензии 0,125%-го энаприлата в КФЧ (Rn 230;360 нм) соответственно.

    Первой и второй группе с тимололом в оба глаза однократно инстиллировали 40 мкл 0,5%-го водного раствора тимолола и 40 мкл суспензии 0,5%-го тимолола в КФЧ соответственно.

    Третья группа (контрольная) получала инстилляции в оба глаза 0,05 М фосфатного буферного раствора, рН=7,4. Предварительно было исследовано влияние пустых КФЧ на величину ВГД у интактных кроликов.

    ВГД измеряли до закапывания и далее в течение 6 часов с интервалом в 1 час с помощью автоматического тонометра для ветеринарии Tonovet (Icare, Финляндия). В каждой временной точке оценивали снижение ВГД по сравнению с исходным в мм рт. ст. Эксперименты на одном кролике проводили с интервалом в 2 недели.

    Результаты и обсуждение

    В результате проведенных исследований наблюдалось достоверное снижение ВГД после инстилляции иАПФ. По динамике изменения ВГД были сопоставимы со снижением его после инстилляции тимолола. После внедрения иАПФ и тимолола в КФЧ обнаружена пролонгация воздействия препаратов на ВГД.

    Исследованные суспензии КФЧ, содержащие эналаприлат (0,125%-й) и лизиноприл (2%-й), при многократных инстилляциях и при ежедневных 3-кратных инстилляциях в течение 5 дней не оказывали раздражающего действия на конъюнктиву, не влияли на целостность эпителия роговицы и состояние оптических сред глаза. Также было показано, что суспензия пустых КФЧ не оказывала влияния на величину ВГД у нормотензивных кроликов. По нашим данным, как и по данным зарубежных исследователей [10], ни пустые КФЧ, ни нагруженные тимололом, не вызывали никаких побочных реакций в виде покраснения, отека, слезотечения и т.п.

    Проведено сравнительное исследование влияния ингибиторов АПФ и тимолола без частиц на ВГД. Сравнение влияния инстилляций кроликам тимолола, лизиноприла (2%-й) и эналаприлата (0,125%-й) показало, что последний более значимо снижает ВГД, по сравнению с препаратами иАПФ (рис. 1).

    Включение в КФЧ усиливало способность эналаприлата (0,125%-й) в растворе снижать ВГД у нормотензивных кроликов (рис. 2).

    Сравнение влияния инстилляций кроликам 0,1%-го лизиноприла и такового, внедренного в КФЧ, показало, что в составе наночастиц он статистически достоверно, т.е. более значимо, снижает ВГД (рис. 3).

    В экспериментах по изучению влияния КФЧ, содержащих 0,5%-й тимолол, на ВГД здоровых кроликов, мы сравнили эффективность его инкапсулированного в КФЧ и аптечного препарата. Из рис. 4 видно, что внедренный в КФЧ тимолол (Rh<140 нм) проявляет более эффективное и пролонгированное действие по сравнению с его водным раствором.

    Эналаприлат, лизиноприл и β-блокатор тимолол в составе наночастиц статистически более значимо снижали ВГД у нормотензивных кроликов, причем гипотензивный эффект был больше и продолжительнее, чем у этих препаратов в простом растворе. Таким образом, внедрение в КФЧ лекарственных препаратов увеличивает их биодоступность, при этом сохраняется их биологическая активность, а эффективность терапевтического действия увеличивается.

    Заключение

    Обнаружено снижение ВГД после инстилляции ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, сопоставимое с динамикой снижения офтальмотонуса после применения тимолола. Внедрение иАПФ и тимолола в состав кальций-фосфатных наночастиц вызывало более эффективное и пролонгированное снижение давления при отсутствии местнораздражающего воздействия. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования КФЧ для включения в них глазных лекарственных препаратов для снижения ВГД, применяемых в виде глазных капель.