Инструментальная и морфологическая оценка изменений стромы роговицы мыши в динамике посттравматического восстановления

    Актуальность

    Травмы, ожоги, химические повреждения, инфекции, хирургические вмешательства и другие воздействия могут приводить к помутнению роговицы. Помутнение роговицы является основной причиной потери зрения. Роговичная слепота, обусловленная помутнением роговицы из-за травмы или изъязвления роговицы, составляет в мире 1,5–2 млн случаев в год [1, 2]. При травмах роговицы происходит нарушение структуры стромального матрикса. Патоморфологические изменения стромы, приводящие к помутнению роговицы после травмы, являются основными факторами, определяющими непрозрачность роговицы [3].

    Строма роговицы представляет собой плотную коллагеновую ткань, населенную покоящимися кератоцитами, ответственными за секрецию специализированного стромального внеклеточного матрикса. Этот матрикс характеризуется слоями плотно упакованных, высокооднородных коллагеновых фибрилл, связанных с уникальным классом кератансульфатсодержащих протеогликанов [4]. Прозрачность роговицы зависит от небольшого диаметра фибрилл, параллельного расположения и регулярного межфибриллярного расстояния коллагена в строме роговицы [5]. Травма, воспаление или инфекция вызывают дифференцировку кератоцитов в фибробласты, митотические клетки, которые секретируют измененные компоненты внеклеточного матрикса, что приводит к образованию стромальных рубцов и снижению прозрачности [6]. Измененный коллагеновый матрикс стабилен, поэтому нарушение зрения носит постоянный необратимый характер.

    Экспериментальные модели различных травм на животных, в том числе и роговицы, широко используются в доклинических исследованиях [5, 7–10]. Для изучения терапевтического потенциала биомедицинских клеточных, бесклеточных продуктов и разработки новых методов лечения необходима стандартизированная и воспроизводимая in vivoмодель травмы стромы роговицы. Согласно данным литературы, стромальную рану создают либо механически хирургическими инструментами [5, 7, 10], либо вызывают повреждение химическими агентами – щелочью [9], жидким азотом [8], коллагеназой [11]. Каждый из используемых методов имеет ряд преимуществ и недостатков. Однако именно механическая травма является методом, наиболее поддающимся оценке и стандартизации, при этом морфологические изменения стромы, особенно в динамике посттравматического наблюдения, остаются малоизученными. В связи с этим актуальной является оценка морфологических изменений стромы после травмы и установление сроков формирования этих морфологических изменений.

    Цель

    Оценить структурно-функциональные изменения стромы роговицы мыши в динамике посттравматического восстановления.

    Материал и методы

    Для эксперимента были взяты 8 самок мышей линии С57ВL/6 возраста 7–8 недель, предоставленные виварием конвенциональных животных ИЦИГ СО РАН. Исследование было утверждено локальным этическим комитетом НИИКЭЛ – филиал ИЦИГ СО РАН (№ 184 от 20 октября 2023 г.). Все процедуры с животными проводились в соответствии с протоколами, утвержденными локальным этическим комитетом, рекомендациями по правильному использованию и уходу за лабораторными животными (Директива Совета Европейских Сообществ 86/609/CEE) и принципами Хельсинкской декларации.

    Для моделирования травмы роговицы использовали один глаз, второй глаз служил в качестве контроля. Процедура моделирования стромальной травмы роговицы выполнялась острой иглой 33G в виде тоннельного дефекта в толщу роговицы в центральной оптической зоне (рис. 1). Создание травмы роговицы мышам проводили под наркозом, путем интраперитонеального введения Золетила-100 30 мг/кг (Virbac Sante Animale, Франция) и Рометара 0,25 мг/кг (Bioveta, Чехия) через инсулиновый шприц с игрой 26G. Перед созданием модели стромальной раны производили оценку исходных функциональных показателей роговиц (толщина, прозрачность и целостность барьерного эпителиального слоя) инструментальными методами исследования: биомикроскопия переднего отрезка глаза на щелевой лампе Carl Zeiss Meditech (Германия) с флюоресцеиновой пробой; оптическая когерентная томография (ОКТ) переднего отрезка глаза на компьютерном оптическом томографе Optovue XR Avanti (США). Перед созданием стромальной раны на роговицу наносили 40% раствор глюкозы («Дальхимфарм», Россия) в течение 1 мин с целью удаления эпителиального слоя роговицы в центральной зоне. До и после проведения хирургических манипуляций в конъюнктивальную полость глаз мышей закапывались антибактериальные и обезболивающие капли: сигницеф – 1 каплю в опытный глаз, алкаин – 1 каплю в опытный глаз.

    Оценка наличия посттравматического повреждения и динамика восстановления роговиц проводилась in vivo на мышах под наркозом, инструментальными методами исследования каждые 2 недели на протяжении месяца: 1) перед созданием травмы роговицы; 2) сразу после создания травмы; 3) через 2 недели после нанесения травмы; 4) через 4 недели после травмы. Перед каждым исследованием осуществлялась интраперитонеальная наркотизация препаратами Золетил-100 30 мг/кг (Virbac Sante Animale, Франция) и Рометар 0,25 мг/кг (Bioveta, Чехия).

    Биомикроскопия переднего отрезка глаза проводилась на щелевой лампе Carl Zeiss Meditech (Германия) с флюоресцеиновой пробой для определения целостности роговиц. Измерение толщины роговиц (пахиметрия) и определение общей степени помутнения роговиц проводили на компьютерном оптическом томографе Optovue XR Avanti (США). Прозрачность роговицы оценивалась методом количественного анализа, соответствующего гиперрефлективности роговицы с помощью программного обеспечения ImageJ (США, Мэдисон, Висконсин) путем определения средней величины градации серого от 0 до 250 (250 соответствует полной непрозрачности) в выделенной области помутнения 150–200 мкм в каждой роговице на полученных ОКТ-снимках [8].

    Через 2 и 4 недели после моделирования травмы роговицы, глаза животных удаляли и фиксировали 4% параформальдегидом в среде Хэнкса и 1% раствором OsO4 с фосфатным буфером (рН 7,4) в течение 1 ч, обезвоживали в этаноле с возрастанием концентрации. Полутонкие срезы роговицы толщиной 1 мкм готовили с использованием микротома Leica EM UC7, окрашивали толуидиновым синим и ориентировали для электронной микроскопии. Полутонкие срезы толщиной 70–100 нм контрастировали насыщенным водным раствором ацетата уранила и цитрата свинца и анализировали на электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol) (Центр коллективного пользования микроскопии биологических объектов ИЦиГ СО РАН, Новосибирск). Морфометрию проводили на цифровых изображениях с помощью программного обеспечения Image J (Wayne Rasband, США), подсчитывая диаметр фибрилл, плотность фибрилл (количество фибрилл на 1 мкм 2 ) и минимальное ближайшее расстояние между фибриллами. Зоной интереса на цифровых изображениях служили участки с поперечным срезом фибрилл. Минимальное ближайшее расстояние между коллагеновыми фибриллами измеряли как минимальное расстояние между центрами двух ближайших между собой фибрилл. При подсчете плотности фибрилл использовали открытую тестовую систему, с шагом тестовой системы 170 или 285 нм. Для анализа использовали не менее 5 фотографий с поперечным срезом фибрилл для каждой группы, подсчитывая не менее 100 фибрилл на каждой фотографии.

    Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения Statistica 7.0 (StatSoft, США). Оценка нормальности распределения данных проводилась с помощью критериев Колмагорова – Смирнова и Шапиро – Уилка, сравнение независимых выборок – непараметрическим критерием Манна – Уитни. Данные по морфологическому анализу диаметра фибрилл, плотности, ближайшего расстояния между фибриллами имели нормальное распределение и анализировались с помощью критерия t-Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.

    Результаты

    Формирование стромальной травмы у мышей (n=8) было подтверждено с помощью биомикроскопии роговицы на щелевой лампе с флюоресцеиновой пробой (рис. 2). Отсутствие накопления флюоресцеина наблюдалось во всех роговицах до травмы, что отражало целостность эпителиального барьера здоровых роговиц. С другой стороны, во всех роговицах после нанесения стромальной травмы наблюдалось накопление флюоресцеина, что свидетельствовало о повреждении эпителиального барьера и накоплении красителя в строме поврежденных роговиц.

    Кроме того, формирование стромальной травмы так-же подтверждали ОКТ переднего отрезка глаза (рис. 3). По данным ОКТ, сразу после травматического воздействия возникал реактивный отек стромы роговицы (рис. 3 б).

    Фиксация данных пахиметрии в 1-й день после нанесения травмы не являлась целесообразной, поскольку в 1-е сутки после травмы наблюдался выраженный нарастающий реактивный посттравматический отек роговиц с положительной флюоресцеиновой пробой (накоплением красителя в месте травмы – эпителии и строме роговицы). Через 2 недели после нанесения механической травмы мы наблюдали полную эпителизацию раневой поверхности (отрицательная флюоресцеиновая проба на щелевой лампе). По данным ОКТ через 2 недели после травмы фиксировалось статистически значимое (p<0,05) повышение толщины роговицы на 34% по сравнению со здоровой роговицей (с 91 до 122 мкм соответственно)(рис. 4). Высокие показатели толщины роговицы (120 [115; 124]) сохранялись к 4-й неделе наблюдения без восстановления до уровня здоровой роговицы (91 [83; 95]) (p<0,05) (рис. 4 б). Реактивный отек роговицы, возникающий сразу после нанесения механической раны, сопровождался увеличением индекса помутнения роговицы (рис. 4 в). Через 2 недели после травмы индекс помутнения увеличился в 1,5 раза по сравнению со здоровой роговицей (с 94 до 137 усл. ед. соответственно) (p<0,05) и продолжал оставаться на высоком уровне до конца эксперимента (p<0,05).

    При проведении морфометрического анализа мы выбирали на цифровых изображениях участки с поперечным срезом фибрилл (рис. 5), на которых подсчитывали диаметр фибрилл, плотность (количество фибрилл в 1 мкм 2 ) и минимальное ближайшее расстояние между коллагеновыми фибриллами. Было выявлено, что после формирования механической травмы стромы роговицы диаметр коллагеновых фибрилл уменьшался в течение всего срока наблюдения. Уменьшение диаметра фибрилл было отмечено уже через 2 недели после травмы по сравнению со здоровой роговицей (30,7±3,3 нм по сравнению с 32±4,6 нм соответственно), достигая наименьшего значения 27,8 нм через 4 недели после формирования травмы (р=0,00) (рис. 6 а).

    Плотность коллагеновых фибрилл в строме роговицы мыши после травмы была выше в течение всего срока наблюдения (2, 4 недели) по сравнению со здоровой роговицей (р=0,00) (рис. 6 б). Через 2 недели после травмы плотность коллагеновых фибрилл увеличивалась в 1,6 раза по сравнению со здоровой роговицей (472/мкм 2 по сравнению с 288/мкм 2 соответственно), затем наблюдалось небольшое снижение плотности на 4-й неделе (р=0,00)

    Минимальное ближайшее расстояние между коллагеновыми фибриллами стромы увеличивалось через 2 и 4 недели после травмы по сравнению со здоровой роговицей (рис. 6 в). Для здоровой роговицы минимальное среднее расстояние между фибриллами составляло 47 нм, а через 2 недели после травмы – 59 нм (р=0,00). К 4 неделям после травмы отмечалось некоторое увеличение минимального среднего расстояния по сравнению с 2 неделями (р=0,00).

    Обсуждение

    Достижения в области регенеративной медицины и создание новейших методов лечения определяют потребность в разработке и оценке моделей стромального помутнения на животных с целью определения их безопасности и эффективности. В литературе можно встретить различные модели помутнения, созданные на разных видах животных. Одной из таких моделей является модель помутнения на кроликах, описанная S.E. Wilson и соавт., вызванная хирургической операций – фоторефракционной кератэктомией. Она позволяет изучить изменения ткани, происходящие в результате поверхностной лазерной абляции. Однако, по сравнению с постъязвенными и посттравматическими помутнениями роговицы, они являются крайне деликатными и име-ют тенденцию к самопроизвольному регрессу с течением времени [12]. С другой стороны, модели химического повреждения действительно приводят к значительному постоянному помутнению роговицы, однако такие повреждения являются глубокими, васкуляризованными и не всегда поддаются визуализации с использованием видимого или инфракрасного света [13]. Другим альтерна-тивным методом создания модели помутнения являет-ся применение коллагеназы для индуцирования ограни-ченного стерильного некролиза в нижележащей стро-ме [14]. Однако данный метод, как и индуцирование по-мутнения инфекционным агентом, довольно трудно вос-производим, сложно поддается стандартизации и может приводить к перфорации роговицы, либо к чрезмерной васкуляризации и спаечному процессу с радужной обо-лочкой глаза [15]. Принимая во внимание все вышеска-занное, в своей работе мы остановились на модели ме-ханической травмы роговицы. В качестве опытных жи-вотных были выбраны мыши, поскольку работа с ними имеет ряд преимуществ, а именно: доступность, просто-та транспортировки животных, возможность создания обширных опытных групп, а также экономическая со-ставляющая.

    Результаты нашего исследования показывают, что мышиная модель стромальной травмы имитировала изменения, схожие с таковыми в роговице человека при травме: изменение толщины и прозрачности (рис. 4). Уже через 2 недели после нанесения травмы наблюдалось значимое увеличение толщины роговицы, свидетельствующее об активном посттравматическом воспалительном процессе – отеке роговицы (рис. 4). Статистически значимое увеличение толщины роговицы по сравнению с группой контроля (р<0,05) сохранялось в течение 4 недель после травмы (рис. 4 б). Также через 2 недели после травмы было выявлено снижение прозрачности роговицы, которое сохранялось на протяжении 4 недель без значимых изменений(рис. 4 в). Отек, возникающий в строме роговицы во время заживления ран, вызывает нарушение расположения коллагеновых фибрилл, помутнение и последующее ухудшение зрительной функции [16, 17]. Травма эпителия обычно вызывает отек подлежащей стромы вследствие потери барьерной функции эпителия, что обеспечивает беспрепятственное «оводнение» стромы. Такой отек сохраня-ется до восстановления целостности эпителия [3]. В на-шем исследовании отек сохранялся и после восстанов-ления целостности эпителия через 2 недели после трав-мы(рис. 4). Выраженный отек роговицы во время зажив-ления может быть следствием ряда факторов. К числу таких факторов можно отнести синтез более крупных молекул протеогликанов (декарин, бигликан) [18], уве-личение количества клеток вследствие пролиферации фибробластов и их последующей трансформации в ми-офибробласты [19]. Эти факторы во время заживления ран являются основными, способствующими наруше-нию синтеза прозрачной коллагеновой матрицы стро-мы роговицы [20].

    Стромальная травма роговицы сопровождается не только увеличением толщины роговицы и снижением ее прозрачности, но и изменением морфологии стромы. В нашем исследовании было выявлено, что травма роговицы приводила к уменьшению диаметра фибрилл, увеличению плотности фибрилл и минимального ближайшего расстояния между коллагеновыми фибриллами (рис. 6). Коллагеновые фибриллы в группе контроля (здоровая роговица) характеризовались одинаковым диаметром (32±4,6 нм), равномерной плотностью упаковки и равномерным межфибриллярным расстоянием. В первые недели после травмы увеличение плотности фибрилл, возможно, было связано с увеличением синтеза коллагена и его упаковкой в фибриллы меньшего диаметра. Так, в работе C. Cintron и соавт. [21] было показано, что после травмы в роговице кролика наблюдается два пика синтеза коллагена для того, чтобы закрыть дефект. Первый пик приходится на 5–7-й день, а второй – на 28-й день после травмы. При этом заживление проникающих ран сопровождается образованием коллагеновых фибрилл различного диаметра. Вариабельность диаме-тра фибрилл в посттравматической роговице очень на-поминает вариабельность волокон в фетальной строме, однако регенерация роговицы не всегда приводит к пол-ному восстановлению прозрачности [21]. Увеличение межфибриллярного пространства в посттравматиче-ской роговице в ранние сроки после травмы, вероят-но, было вызвано отеком роговицы. Нарушение упаков-ки коллагеновых фибрилл с изменением плотности и межфибриллярного пространства в более поздние сро-ки после травмы (4 недели) происходит, по-видимому, за счет синтеза миофибробластами фибротического кол-лагена III. Раннее D. Ghoubay и соавт. показали, что фор-мирование непрозрачной коллагеновой матрицы стро-мы после повреждений связано с синтезом коллагена III. Экспрессия гена коллагена III считается маркером руб-цевания [8].

    Таким образом, нами было выявлено, что восстановление роговицы после механической травмы протекало медленно и не сопровождалось полноценным восстановлением толщины, прозрачности и морфологической организации стромы роговицы в течение 4 недель наблюдения.

    Заключение

    Механическая модель травмы роговицы, вызванная острой иглой, вызывает формирование стабильного стромального помутнения, которое вероятно, сопоставимо с такими же процессами и механизмами в человеческом глазу. В ранний срок до 4 недель после травмы отмечается выраженный отек роговицы, сопровождающийся увеличением толщины роговицы и уменьшением ее прозрачности, снижением диаметра фибрилл, а также увеличением плотности фибрилл и межфибриллярного расстояния. Стадия выраженного фиброзирования роговицы мыши характеризуется сохранением увеличенной толщины роговицы, стойким помутнением, малым диаметром фибрилл с высокой плотностью упаковки и большим межфибриллярным расстоянием. Следует отметить, что на всем сроке наблюдения после механической травмы (4 недели) ни инструментальными, ни морфологическими методами исследования не было выявлено восстановления стромы до уровня здоровой роговицы.

    

    Информация об авторах

    Мария Александровна Суровцева, к.м.н., mfelde13@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4752-988X

    Кристина Юрьевна Краснер, младший научный сотрудник, врач-офтальмолог, kityli@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-1921-8072

    Наталья Анатольевна Бондаренко, к.б.н., bond802888@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-8443-656X

    Ирина Иннокентьевна Ким, к.м.н., kii5@yandex.ru, https://orcid. org/0000-0002-7380-2763

    Елена Васильевна Чепелева, к.б.н., e_chepeleva@meshalkin.ru, https://orcid.org/0000-0003-0715-4451

    Наталия Петровна Бгатова, д.б.н., профессор, nataliya.bgatova@ yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4507-093X

    Вероника Викторовна Дулидова,врач-офтальмолог, NicaPatrin@ mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5494-3771

    Александр Николаевич Трунов, д.м.н., профессор, руководитель научного отдела Новосибирского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, главный научный сотрудник ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины», trunov1963@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-7592-8984

    Валерий Вячеславович Черных,д.м.н., профессор, директор Новосибирского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, rimma@mntk.nsk.ru, https:// orcid.org/0000-0002-7615-8512

    Ольга Владимировна Повещенко,д.м.н., poveschenkoov@yandex. ru, https://orcid.org/0000-0001-9956-0056

    Information about the authors:

    Mariya A. Surovtseva,PhD in Medicine, mfelde13@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4752-988X

    Kristina Yu. Krasner, Junior Researcher, Ophthalmologist, kityli@mail. ru, https://orcid.org/0000-0002-1921-8072

    Natal’ya A. Bondarenko, PhD in Biology, bond802888@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-8443-656X

    Irina I. Kim, PhD in Medicine, kii5@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-7380-2763

    Elena V. Chepeleva,PhD in Biology, e_chepeleva@meshalkin.ru, https://orcid.org/0000-0003-0715-4451

    Nataliya P. Bgatova,Doctor of Sciences in Biology, Professor, nataliya. bgatova@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4507-093X

    Veronika V. Dulidova, Ophthalmologist, NicaPatrin@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5494-3771

    Alexandr N. Trunov, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Head of the scientific department S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk branch, Chief Researcher of the Federal Research Center for Fundamental and Translational Medicine, trunov1963@yandex. ru, https://orcid.org/0000-0002-7592-8984

    Valerii V. Chernykh, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Director of the Novosibirsk branch, of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, rimma@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-7615-8512

    Olga V. Poveshchenko, Doctor of Sciences in Medicine, poveschenkoov@ yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9956-0056

    Вклад авторов в работу:

    М.А. Суровцева:существенный вклад в концепцию и дизайн работы, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, редактирование.

    К.Ю. Краснер: анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Н.А. Бондаренко: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    И.И. Ким: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Е.В. Чепелева: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Н.П. Бгатова:сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    В.В. Дулидова: сбор, анализ и обработка материала.

    А.Н. Трунов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование.

    В.В. Черных: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование.

    О.В Повещенко: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Authors’ contribution:

    Mariya A. Surovtseva: significant contribution to the concept and design of the work, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    Kristina Yu. Krasner: analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    Natal’ya A. Bondarenko:collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    Irina I. Kim: collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    Elena V. Chepeleva: collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    Nataliya P. Bgatova: collection, analysis and processing of material, writing.

    Veronika V. Dulidova:collection, analysis and processing of material.

    Alexandr N. Trunov:significant contribution to the concept and design of the work, writing.

    Valerii V. Chernykh: significant contribution to the concept and design of the work, editing.

    Olga V. Poveshchenko: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.

    Финансирование: Работа проведена в рамках государственного задания Минобрнауки по теме № 122022800132-1 и МЗ РФ по теме № 124030400004-8.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The work was carried out within the framework of the state assignment of the Ministry of Education and Science on topic No. 122022800132-1 and the Ministry of Health of the Russian Federation on topic No. 124030400004-8.

    Patient consent for publications: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: There is no conflict of interest.

    Поступила: 26.05.2024

    Переработана: 29.06.2024

    Принята к печати: 29.07.2024

    Originally received: 26.05.2024

    Final revision: 29.06.2024

    Accepted: 29.07.2024