Бактериальный эндофтальмит — внутриглазной инфекционный процесс, вызванный попаданием микроорганизмов в витреальную полость. Данное осложнение является следствием операций, травм, сопровождающихся повреждением фиброзной оболочки глаза. Тяжесть инфекционного процесса обусловлена быстрым размножением микроорганизмов, а также токсическим поражением нейросенсорного, пигментного эпителия и зрительного нерва в первые 12-24 часа от начала заболевания. Лечение эндофтальмита всегда связано с трудностью выбора эффективной дозы и рационального пути введения антибактериального препарата [3, 7, 10, 13, 21].
В последнее время при лечении инфекционных поражений кожных покровов, заболеваний полости рта, все шире применяется методика антимикробной фотодинамической терапии (АФДТ). В основе антибактериального действия АФДТ лежит способность химических соединений — фотосенсибилизаторов (ФС) – адсорбироваться на поверхности мембран микроорганизмов и разрушать их при воздействии облучения. При этом происходит образование синглетного кислорода и свободных радикалов, имеющих короткий срок существования и действующих на малых расстояниях. Способность ФС к избирательному накоплению в быстро делящихся клетках позволяет рассчитывать на получение антимикробного эффекта с минимальным повреждением окружающих тканей [17, 18].
Цель работы — оценить эффективность интравитреальной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором N-диметилглюкаминовой соли хлорина Е6 в лечении экспериментального эндофтальмита.
Материал и методы
Исследование включало в себя оценку эффективности АФДТ in vitro в отношении культуры Enterococcus faecium и in vivo на модели бактериального эндофтальмита у кроликов.
Оценку антимикробного действия фотодинамической терапии (ФДТ) проводили на примере грамположительного микроорганизма Enterococcus faecium, выделенного из витреальной полости больного эндофтальмитом. По данным предварительных микробиологических исследований, микроорганизм обладал чувствительностью к клафорану.
В качестве ФС использовали водный раствор фотосенсибилизатора N-диметилглюкаминовой соли хлорина Е6. Источником излучения служил диодный лазер «Алод01» с длиной волны 662 нм (ООО «АЛКОМ-МЕДИКА», Санкт– Петербург).
Микробиологические исследования in vitro. Для приготовления микробной взвеси использовали стандарт мутности 5 Единиц (Международный ОСО 42.28.86.07П). В лунки 96-луночного планшета вносили по 0,.1 мл взвеси микроорганизмов в количестве (0,85х108КОЕ) и 0,1 мл раствора ФС в различной концентрации (0,1%, 0,01%, 0,001%). В качестве растворителя использовали 0,9% изотонический раствор хлорида натрия. После добавления ФС культуру инкубировали при 37 оС без доступа света в течение 10-15 мин. Затем производили облучение лазером в лунках стерильного планшета (ТУ 64-2-278-79). Световую дозу подводили перпендикулярно поверхности с помощью моноволоконного кварцевого световода (∅ 800 мкм) с прямым выходом излучения. Плотность энергии лазерного излучения составляла 1, 5, 10, 15, 30 Дж⁄см². Затем производили высев в объеме 10 мкл от общего объема рабочей смеси на селективную питательную среду.
Антибактериальное действие ФДТ оценивали по количеству выживших колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 часа. Число КОЕ после ФДТ сопоставляли с количеством выживших облученных несенсибилизированных ФС культур, необлученных сенсибилизированных и необлученных несенсибилизированных микроорганизмов.
Исследование in vivo, состоящее из нескольких этапов, проводили на 80 глазах 40 кроликов породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте 6 мес.
На I этапе на обоих глазах экспериментальных животных выполняли факоэмульсификацию прозрачного хрусталика. Выбор этой операции в качестве предварительного хирургического вмешательства объясняется необходимостью исключить развитие катаракты при моделировании экспериментального эндофтальмита и, таким образом, иметь возможность оценивать степень тяжести воспалительного поражения внутриглазных структур в различные сроки послеоперационного наблюдения [3, 20].
На II этапе через 20-30 дней после факоэмульсификации и клинического успокоения глаз создавали экспериментальную модель экзогенного бактериального эндофтальмита. Для этого после проведения стандартной анестезии под контролем операционного микроскопа на обоих глазах подопытных животных производили прокол склеры в верхнем наружном квадранте на расстоянии 2 мм от лимба, используя одноразовые шприцы и иглы. Через иглу шприца производили забор стекловидного тела в количестве 0,2 мл. Культуру микроорганизмов предварительно центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об⁄мин, надосадочную жидкость удаляли микропипеткой, а 0,2 мл приготовленной культуры Enterococcus faecium в заведомо высокой дозе 8,5 х107 микробных тел вводили в витреальную полость [8, 12, 14, 16].
На III этапе экспериментальные животные были разделены на четыре группы по 10 особей. В 1-й группе после заражения проводили изучение естественного инфекционного процесса в различные сроки (без лечения). Во 2-й группе не позднее 12 часов после заражения проводили субтотальную витрэктомию по стандартной методике. В 3-й группе в указанные сроки также проводили витрэктомию, где в качестве ирригационного раствора использовали раствор клафорана в дозе 16 мкг⁄мл [3, 10, 12]. В 4-й группе проводили витрэктомию и АФДТ по предложенной нами методике. Витрэктомию выполняли не позднее 12 часов после заражения, что объясняется наличием определенного периода времени после введения возбудителя в полость глаза (в среднем 12 часов), по истечении которого лечение становится абсолютно неэффективным [4].
Техника операции. Всем животным до операции в конъюнктивальную полость закапывали 1% раствор атропина и ретробульбарно вводили 0,5 мл 4% раствора лидокаина. Операцию проводили под внутривенным наркозом (10% гексенал из расчета 10-15 мг⁄кг веса животного). Выполняли субтотальную витрэктомию по стандартной трехпортовой методике. В переднюю камеру через парацентез роговицы вводили раствор вискоэластика в объеме 0,1-0,2 мл для защиты эндотелия от случайного попадания ФС. Производили обмен вода-газ, в витреальную полость вводили раствор ФС 0,001% до уровня радужки, после чего глаз герметизировали на 10 мин. По истечении этого срока раствор ФС удаляли из глаза, проводя повторно замену «вода-газ». Через склеротомическое отверстие в витреальную полость вводили моноволоконный кварцевый световод с диффузором и проводили интравитреальное облучение лазером с длиной волны 662 нм и минимальной плотностью энергии 5 Дж⁄см². По завершении операции на склеротомические отверстия и конъюнктиву накладывали узловые швы 8-0. Ни в одном случае не было отмечено интраоперационных осложнений.
IV этапом явились клинические и морфологические исследования. Сразу после заражения, через 12, 24, 48 и 72 часа всем экспериментальным животным проводили биомикроскопию с использованием щелевой лампы фирмы «Opton» (Германия), непрямую офтальмоскопию при помощи бинокулярного офтальмоскопа фирмы «Heine» (Германия). Выраженность воспалительных изменений оценивали по 4 степеням [9, 15]:
· 1-я степень: незначительная гиперемия конъюнктивы, радужки и отек роговицы, единичные преципитаты, в передней камере 5-10 клеток в поле зрения, глазное дно легко офтальмоскопируется;
· 2-я степень: умеренная гиперемия конъюнктивы и умеренно выраженный отек роговицы, преципитаты, множественные воспалительные клетки во влаге передней камеры, гипопион до 2 мм, рисунок радужки стушеван, плавающие помутнения в стекловидном теле, рефлекс снижен, детали глазного дна под густым флером или не офтальмоскопируются;
· 3-я степень: тяжелая выраженная инъекция гиперемия конъюнктивы, выраженный отек и преципитаты роговицы, гипопион более 2 мм, рефлекса с глазного дна нет;
· 4-я степень: тотальный отек роговицы и⁄или гипопион, заполняющий всю переднюю камеру, глубже лежащие структуры не офтальмоскопируются.
После биомикроскопии и офтальмоскопии проводили электроретинографию (ЭРГ) с использованием электродиагностической системы «Tomey» (Япония). В качестве активного электрода использовался серебряный электрод-петля и кожные иглы (референтный и заземляющий электроды), располагающиеся соответственно на правом и левом ушах кроликов. Максимальный ответ в темно-адаптированном глазу (10 мин) получали при использовании стандартного стимула Ganzfeld для генерации вспышки белого цвета с интенсивностью 1,8 cd⁄m2, с частотой 0,1 Гц. За норму были приняты следующие показатели ЭРГ: амплитуда a-волны – 51+5,6 мкВ, время — 15+1,5 мс и амплитуда b-волны — 125+15,1 мкВ, время — 36+1,7 мс. Угнетение функции сетчатки оценивался как соотношение амплитуды b-волны зараженного глаза к амплитуде b-волны глаза после интравитреального введения физиологического раствора.
После клинического исследования из каждого глаза брали по 0,2 мл содержимого витреальной полости для дальнейшего микробиологического исследования. Далее глаза энуклеировали. Глазные яблоки фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, далее промывали проточной водой, вырезали центральную колодку, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (70о, 80о, 90о, 96о) и заливали в парафин. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Гистологические препараты исследовали под микроскопом и фотографировали. Оценка гистологических изменений проводилась по степени выраженности патологических изменений в роговице, передней камере, радужке, задней камере, цилиарном теле, капсуле хрусталика, хориоидее, стекловидном теле, сетчатке и зрительном нерве. Степень реакции оценивали в баллах [6, 9, 15, 19]:
0 — строение тканей в пределах нормы;
1 — мягкая реакция (рассеянные воспалительные клетки и фибринозный экссудат);
2 — умеренная реакция (в тканях и полостях находятся воспалительные клетки и нейтрофилы);
3 — выраженная реакция (большие пласты нейтрофилов в передней и задней камере, множественные нейтрофилы в тканях, участки некроза сетчатки).
Результаты
Рис. 1. Зависимость количества Log КОЕ от концентрации фотосенсибилизатора и плотности энергии лазера
Рис. 2. Зависимость обсемененности витреальной полости Enterococcus faecium от времени с момента заражения
В ходе проведенных экспериментов in vitro был установлен антимикробный эффект после облучения культуры, сенсибилизированной различными концентрациями раствора ФС, который по степени угнетения роста оценен как бактериостатический, нарастающий с увеличением плотности энергии лазерного излучения, выраженный уже при плотности энергии 5 Дж⁄см², и максимальный при использовании раствора ФС в концентрации 0,01%, 0,001% (рис. 1). В контрольных образцах, облученных лазером, либо с введением растворов ФС без лазерного облучения, отмечался сливной рост микроорганизмов.
Из полученных результатов видно, что минимальная бактериостатическая концентрация ФС составляет 0,001% в сочетании с лазерным излучением с плотностью энергии 5 Дж⁄см². При этих условиях достигается резкое уменьшение количества выживших микроорганизмов. Таким образом, для проведения дальнейших экспериментов мы использовали концентрацию ФС 0,001% и плотность энергии 5 Дж⁄см².
В результате микробиологических исследований in vivo (забор содержимого витреальной полости в различные сроки после заражения) были получены следующие результаты (рис. 2). Сразу после заражения количество микроорганизмов резко возрастало. В период с 24 до 72 часов наблюдалось некоторое уменьшение количества микроорганизмов, высеваемых из витреальной полости. Это связано, на наш взгляд, с развитием иммунных реакций в ответ на введение инфекционного агента. Из исследования были исключены 4 животных, погибших в данный период из-за септических осложнений [11].
Рис. 3. Зависимость количества КОЕ, высеваемых из витреальной полости, в зависимости от времени с момента заражения и способа лечения экспериментального эндофтальмита
Рис. 4. Сумма баллов выраженности клинических проявлений воспаления в зависимости от времени с момента заражения и способов лечения экспериментального эндофтальмита
При сравнении микробной обсемененности витреальной полости в зависимости от применяемых методов лечения было выявлено, что проведение витрэктомии значительно уменьшает количество микроорганизмов (рис. 3). Однако в послеоперационном периоде происходит повторный значительный рост количества микроорганизмов, что связано, на наш взгляд, с невозможностью стерилизации внутриглазных структур в ходе стандартной витрэктомии. Проведение АФДТ по предложенной методике позволяет значительно уменьшить количество микроорганизмов в витреальной полости как сразу после вмешательства, так и в период до 72 часов. Аналогичные данные получены и при применении витрэктомии с использованием раствора клафорана.
Таким образом, в результате проведенных исследований показана сходная антимикробная эффективность витрэктомии с раствором клафорана и витрэктомии в сочетании с AФДТ по предложенной методике. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием многофакторного анализа (R-квадрат = 0,985176).
На следующем этапе экспериментальной работы была выявлена зависимость степени клинических изменений от времени после заражения и методов лечения. Оценка проводилась по приведенной выше шкале. Было установлено, что с течением времени в период от момента заражения до 72 часов происходило нарастание выраженности воспалительного процесса у животных без лечения и животных, которым проводили только витрэктомию. При проведении витрэктомии с клафораном либо витрэктомии в сочетании с АФДТ происходит стихание явлений воспаления. Как видно из приведенных данных (рис. 4), клиническая картина при использовании антибиотика и AФДТ сходная, что позволяет сделать вывод об эффективности предложенной методики в лечении экспериментального эндофтальмита.
Функции сетчатки после интраокулярного введения культуры оценивали по угнетению амплитуды b-волны ЭРГ (рис. 5). Статистически достоверным является различие между контрольными глазами без лечения, глазами с проведением изолированной витрэктомии и глазами, пролеченными по одной из комбинированных методик с применением клафорана или АФДТ (р<0,005).
Рис. 5. Степень угнетения b-волны электроретинограммы (в %) по сравнению с контролем в зависимости от времени с момента заражения и способа лечения экспериментального эндофтальмита
Рис. 6. Сумма баллов выраженности гистологических изменений в зависимости от времени с момента заражения и способов лечения экспериментального эндофтальмита
В целом динамика угнетения электроретинограммы повторяет и подтверждает динамику изменения клинических проявлений воспаления.
После проведения гистологических исследований их результаты были оценены в соответствии с приведенными выше степенями выраженности изменений. На рис. 6. отражена сумма гистологических изменений различных внутриглазных структур в зависимости от времени с момента заражения и проведенного лечения. Приведенные данные также подтверждают усиление явлений воспалительной реакции с течением времени при отсутствии лечения. При поведении витрэктомии в сочетании с антибиотикотерапией или АФДТ степень выраженности гистологических изменений была достоверно ниже по сравнению с изолированной витрэктомией (р<0,005).
Обсуждение
Увеличение антибиотикорезистентности микроорганизмов является одной из ведущих проблем медицины. Создание новых антибиотиков — это сложный и длительный процесс. Даже после получения перспективное лекарственное средство должно пройти длинный путь подтверждения его безопасности и эффективности. В результате чего в последние годы в литературе появились множественные сообщения о возможности разработки новых нетрадиционных средств антимикробной терапии [1, 2 5]. Целью таких исследований является не только возможность подавления устойчивой микрофлоры, но и ограничение появления полирезистентных микроорганизмов. Одним из таких «альтернативных» методов является антимикробная фотодинамическая терапия.
Интравитреальное введение микроорганизмов на афакичном глазу кроликов позволило создать модель экспериментального эндофтальмита. Проведение в комплексе с витрэктомией антимикробной фотодинамической терапии значительно повлияло на течение инфекционного процесса. При использовании предложенной методики не достигается полная стерилизация внутриглазных структур, но значительно уменьшается микробная обсемененность витреальной полости, клиническая выраженность воспалительной реакции и стабилизируются функции нейрорецепторного аппарата в ближайшем послеоперационном периоде. Предложенная методика интравитрельной АФДТ, по данным проведенных исследований, является эффективной в лечении экспериментального эндофтальмита, вызванного грамположительными микроорганизмами.
Заключение
По нашему мнению, необходимо проведение дальнейших исследований по изучению возможности применения предложенной методики в лечении экспериментального эндофтальмита, вызванного возбудителями других групп (грамотрицательными бактериями, грибами), а также изучение безопасности АФДТ для внутриглазных структур.
Поступила 08.09.08
