Таблица 1 Ожидаемые и наблюдаемые частоты распределения генотипов полиморфизма C634G гена VEGFA по равновесию Харди-Вайнберга в группе больных СД
Таблица 2 Ожидаемые и наблюдаемые частоты распределения генотипов полиморфизма C634G гена VEGFA по равновесию Харди-Вайнберга в популяционной выборке
В настоящее время по медико-социальной значимости СД занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и является ведущей причиной инвалидности и смертности в результате развития сосудистых осложнений. Диабетическая ретинопатия (ДР) – наиболее тяжелое осложнение сахарного диабета, в равной степени характерное как для СД 1 типа, так и для СД 2 типа, является в настоящее время одной из основных причин слепоты в развитых странах мира в возрастной группе от 20 до 65 лет. СД 2 типа является многофакторным заболеванием с наследственной предрасположенностью. Какого-то одного гена, полиморфизм которого определяет предрасположенность к СД 2 типа, не обнаружено. Несмотря на достигнутые успехи мирового научного сообщества в области изучения генома человека и в разработке новых методов анализа ДНК, по-прежнему только частично можно объяснить отдельные звенья иммунопатогенеза некоторых мульфакториальных заболеваний (МФЗ). При этом данные проводимых мета-анализов по результатам исследований ассоциаций иммуногенетических маркеров с предрасположенностью к МФЗ зачастую противоречивы в различных популяциях мира. Поэтому не стоит забывать, что распределение определенных полиморфных вариантов генов среди больных МФЗ имеет свои этногеографические особенности [2].
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) может играть важную роль в прогрессировании изменений, вызванных гипергликемией, важного фактора
риска при диабетических осложнениях [3, 4]. VEGF – мощный мультифункциональный цитокин, играющий ключевую роль в патогенезе диабетических микрососудистых осложнений [5, 7, 9]. Имеющиеся на настоящий момент сведения о роли нарушений ангиогенеза, а именно роли VEGF в патогенезе СД и его сосудистых осложнений, являются противоречивыми.
Предполагается, что полиморфизм гена может влиять на развитие сосудистых осложнений при диабете [8]. Несколько SNP полиморфизмов VEGF гена ассоциированы с уровнем экспрессии белка. Выявлено существенное увеличение частоты VEGF –2578 CC генотипа в группе с заболеванием периферических артерий по сравнению с другим сосудистым осложнением диабета – диабетической ретинопатией, а VEGF –2578 СА генотипа у пациентов с диабетической ретинопатией – относительно пациентов с заболеванием периферических артерий. Это свидетельствует о генетических особенностях предрасположенности к определенным сосудистым осложнениям при диабете [6].
Цель
Изучить частоту распределения аллелей и генотипов полиморфизма C634G гена VEGF-A у пациентов с непролиферативной диабетической ретинопатией (НДР).
Материал и методы
В исследование были включены 40 больных СД 2 типа (17 мужчин и 23 женщины) в возрасте от 48 до 70 лет (средний возраст – 51±2,92 года) без ретинопатии, а также с НДР, и 50 практически здоровых лиц (средний возраст – 31,2±0,5 года), проходивших офтальмологическое обследование в РСНПМЦМГ. Все пациенты с СД 2 типа были разделены на 2 группы: 1 группа – 22 больных СД 2 типа без признаков ДР (9 мужчин и 13 женщин) в возрасте от 48 до 65 лет (средний возраст – 55±4,63 года); 2 группа – 18 больных с НДР (8 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 49 до 70 лет (средний возраст – 57,56±2,27 года).
Диагноз сахарного диабета 2 типа был выставлен эндокринологом в соответствии с критериями МКБ. Диагноз НДР выставлен на основании данных офтальмоскопии с максимально расширенным зрачком. Стадия ретинопатии устанавливалась по классификации, принятой ВОЗ, согласно которой диабетическая непролиферативная ретинопатия характеризуется следующими изменениями сетчатки: наличием в сетчатой оболочке глаза патологических изменений в виде микроаневризм, точечных или мелких штрихообразных кровоизлияний тёмного цвета, локализованных в центральной зоне глазного дна или по ходу крупных вен в глубоких слоях сетчатки, экссудативных очагов (локализующихся в центральной части глазного дна, жёлтого или белого цвета с чёткими или расплывчатыми границами) и отёком сетчатки, локализующимся в центральной (макулярной) области или по ходу крупных сосудов.
У всех больных СД и у 50 здоровых неродственных доноров узбекской национальности, составивших контрольную группу, проведено ПЦР генотипирование полиморфизма C634G гена VEGF-A в лаборатории молекулярной генетики НИИ гематологии и переливания крови. Взятие крови осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых больных в стерильных условиях. Выделение ДНК из периферической крови проводили с использованием стандартного набора Рибо-сорб (AmpliSens®, Россия). ПЦР генотипирование полиморфизма C634G гена VEGF-A осуществляли с помощью термоциклера «Applied Biosystems» 2720 (США), с использованием тест-набора компании ООО «Литех» (Москва) согласно инструкции производителей.
Оценка отклонения частот наблюдаемого и ожидаемого генотипов от канонического распределения Харди-Вайнберга проводилась с помощью компьютерной программы «GenePop». Коэффициент отклонений вычисляли по формуле: D=(Hobs-Hexp)/Hexp, где: hobs и hexp – наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность соответственно.
Таблица 3 Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности полиморфизма C634G гена VEGFA от наблюдаемой (D)
Таблица 4 Частота распределения аллелей и генотипов полиморфизма C634G гена VEGFA в группе пациентов СД 2 типа
Результаты
Длительность течения СД у пациентов составила в среднем 7,5±1,8 года. При анализе клинико-функциональных показателей больных СД было выявлено, что у 22 больных СД 2 типа признаков ДР обнаружено не было и средняя острота зрения с коррекцией составила 0,7±0,12. У больных с НДР (18 больных) при офтальмоскопии в условиях медикаментозного мидриаза на глазном дне обнаружены микроаневризмы, петехиальные кровоизлияния, расширение капилляров, местами твердые экссудаты. Средняя острота зрения с коррекцией у этих больных составила 0,42±0,11. У всех больных тонометрическое ВГД находилось в пределах нормы: от 16 до 22 мм рт.ст. (в среднем 18,2±2,9 мм рт.ст.).
Выявлено, что распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма C634G гена VEGFA в обеих группах соответствовало ожидаемому закону равновесия Харди-Вайнберга (р>0,05) (табл. 1-3).
Обсуждение
При исследовании полиморфизма C634G гена VEGFA отмечается тенденция к снижению частоты аллеля С у пациентов с диабетической ретинопатией по сравнению со здоровыми донорами (52,5 против 70,0% соответственно) и статистически значимое повышение частоты аллеля G по сравнению с этой группой (47,5 против 30,0% соответственно; χ²=5,8; Р=0,02; OR=2,1; 95% CI 1.144, 3.896) (табл. 4). Предварительный анализ показывает статистически значимые различия распределения аллелей данного полиморфизма с отношением шансов, равным 2,1 (χ²=5,8; Р=0,02; OR=2,1; 95% CI 1.144, 3.896). Самым распространенным генотипом данного локуса как в группе контроля, так в группе пациентов, является гаплотип C/G, соответственно 50,0 и 36,0%. Гомозиготный дикий С/C генотип также встречался с относительно высокой частотой 52,0% в контрольной группе и 27,5% – в группе больных, генотип G/G, соответственно 12,0 и 22,5%. Выявлена заметная тенденция к увеличению количества гетерозигот C/G и гомозигот в группе пациентов по сравнению с контрольной группой (соответственно 50,0 против 36,9%, 1,2; Р=0,2; OR=1,8; 95% CI 0.7621, 4,14 и 22,5 против 12,0%, χ²=1,8; Р=0,1; OR=2,0; 95% CI 0.6874, 6.594 соответственно).
Полученные результаты по полиморфизму C634G гена VEGFA продемонстрировали высокую частоту встречаемости мутантного аллеля G среди больных ДР по сравнению с группой контроля. Данный факт позволяет высказать предположение о функциональной значимости носительства 634G аллеля в развитии диабетической ретинопатии.
Заключение
Таким образом, в результате проведенного исследования полиморфного локуса C634G гена VEGFA у больных СД 2 типа обнаружены выраженные различия в распределении частот аллелей и генотипов между группой больных и здоровыми индивидами в узбекской популяции. При наличии неблагоприятного аллеля G риск развития диабетической ретинопатии увеличивается более чем в 2,1 раза (χ²=5,8; Р=0,02; OR=2,1; 95% CI 1.144, 3.896), что свидетельствует о достаточно независимом и самостоятельном эффекте полиморфизма C634G гена VEGFA на риск развития диабетической ретинопатии.
