Исследование ключевых компонентов сигнальных путей в клетках ретинального пигментного эпителия, координирующих регенерацию и патологии сетчатки

    Актуальность

    Регенеративный потенциал существенно отличается у высших и низших позвоночных [1]. Повреждение сетчатки глаза приводит к ее регенерации у низших позвоночных P. waltl. из клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Пролиферация клеток-предшественников, образующихся в результате трансдифференцировки клеток РПЭ, обеспечивает продукцию всех типов нейронов и глии и восстановление сетчатки. Эти животные служат моделями для изучения регуляции клеточных процессов восстановления сетчатки (дифференцировки, миграции, пролиферации, гибели клеток) [2, 3]. РПЭ обеспечивает функциональную поддержку нейронов сетчатки и сосудистой оболочки благодаря скоординированной работе эндогенных регуляторных систем и сбалансированной секреции факторов роста [4–6].

    Межклеточная регуляция (аутокринная, паракринная) в сетчатке и пограничных тканях включает многочисленные сигнальные механизмы. Сигнальные белки (Fgf2, Tgfb2, Bmp, Shh, Wnt и др.) создают градиенты концентрации [7], при взаимодействии с определенным набором регуляторов, в том числе секретируемыми внеклеточными везикулами [8], участвуют в контроле пролиферативной активности, функциональной специализации и жизнедеятельности клеток сетчатки. Нарушения механизмов передачи сигналов в клетках приводят к заболеваниям, связанным с гибелью клеток РПЭ, нейронов и глии сетчатки (пролиферативная ретинопатия, макулярная дистрофия сетчатки, диабетическая ретинопатия), сопровождающихся эпителиально-мезенхимным переходом (ЭМП) [9].

    Исследования с применением экспериментальных моделей in vivo и in vitro позволяют расширить представления о сигнальных молекулах, участвующих в механизмах регенерации и дегенерации сетчатки.

    Цель

    Исследование сигнальных путей, участвующих в эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП) в РПЭ человека. Задачи работы: анализ локализации сигнальных белков из суперсемейства TGF (Tgfb2, Bmp4), семейства Fgf (Fgf2) в клетках РПЭ и сетчатки после разобщения этих тканей в процессе их восстановления у P. waltl; выявление общих и специфических генов для анализируемых сигнальных путей, участвующих в эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП) в РПЭ человека.

    Материал и методы

    Объект исследования – половозрелые хвостатые амфибии (P. waltl), возраст 9 мес, разводимые в аквариальной ИБР РАН, модель 3D-in vitro органотипического культивирования заднего сектора глаза. Все протоколы экспериментов на животных одобрены Комиссией по биоэтике ИБР РАН.

    Операцию отслойки сетчатки после наркотизации животных в MSS222 проводили по ранее описанному методу [10]. Исследования локализации белков проводили с применением методов флуоресцентной иммунохимиии. Глаза фиксировали в течение ночи при 4 °C в 4% параформальдегиде, разведенном в PBS. Затем промывали PBS с 0,1% Triton-X100 (PBST), промывали в PBST. Замороженные срезы глаза получали на криостате Leika M101 (Germany), инкубировали в течение 1 ч в блокирующем растворе, состоящем из смеси 3% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США), 1% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США), 0,1% Тритона X-100 (Sigma-Aldrich, США), 0,01% Твина-20 (Sigma-Aldrich, США) и 0,01 М PBS (pH 7,4), затем инкубировали в течение ночи при 4 °C в смеси блокирующего раствора и первых антител.

    Первые кроличьи антитела (SigmaAldrich, США) к антигенам Тgfb2, Fgf2, Вmp4 использовали в разведении 1 : 500. Препараты промывали PBST, инкубировали с вторичными антителами: козьи антикроличьи IgG-антитела, конъюгированные с флуорохромами Алекса-488 (Invitrogen, 1 : 1000) или IgG-антитела Алекса-546 (Invitrogen, 1 : 1000). Специфичность иммунореакции оценивали путем отрицательного контрольного окрашивания, без добавления первых антител. Визуализацию проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Leika DM. Бионформационный анализ сигнальных путей проводили с использованием программного обеспечения Clue Go (version 2.5.7) Cytoscape (version 3.7.2), баз данных открытого доступа по РНК-секвенированию клеток РПЭ [https:// www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/genesets.jsp].

    Результаты и обсуждение

    Проведено сравнительное исследование локализации сигнальных белков, которые являются ключевыми компонентами регуляторных сигнальных путей, в клетках сетчатки в процессе ее регенерации, в сопоставлении с клетками нативной ткани.

    В нативной сетчатке тритона белок Bmp4 (bone morphogenetic protein-4) выявлен в клетках наружного ядерного слоя (НЯС, фоторецепторы), внутреннего ядерного слоя (ВЯС, амакриновые клетки), слое ганглиозных клеток. В процессе регенерации сетчатки локализация белка определена в нейробластах с нарастанием иммунохимического сигнала в ганглиозных клетках, которые дифференцируются первыми, а также в клетках НЯС, ВЯС на последовательных стадиях регенерации сетчатки.

    Bmp4 иммунопозитивные клетки обнаружены в эпителии нативного хрусталика.

    Bmp4 высоко экспрессируется в пигментном эпителии сетчатки и внеклеточном матриксе. Bmp4, вместе с другими белками семейства Bmp, участвует в специализации клеток РПЭ, действуя как антагонист сигналов FGF [11]. В сетчатке (нейроны, РПЭ) Bmp4 является негативным регулятором роста, который временно подавляется травмой, чтобы обеспечить восстановление тканей. Bmp4 проявляет эффект, ингибирующий эпителиально-мезенхимный переход (ЭМП) в РПЭ, при пролиферативной витреоретинопатии (ПВР) [12]. Возрастание уровня экспрессии BMP4 отмечено при возрастной макулярной дегенерации в клетках РПЭ, где BMP4 может ингибировать TGF-β-опосредованный ЭМП [13]. Нарушение сигналов BMP4 служит причиной дисфункции эндотелиальных клеток сетчатки при диабетической ретинопатии, поддержание физиологического уровня этого белка рассматривается в качестве подхода для сохранения гематоретинального барьера [14]. В поврежденной сетчатке крыс

    Bmp4 выполняет функцию стимулятора продукции ганглиозных клеток [15]. Усиление сигналов BMPs путем активации белков Smad1 оказывает нейропротекторный эффект для ганглиозных клеток поврежденной сетчатки [16]. В клетках глии Мюллера у мышей (C57BL6) временная активация сигналы BMP необходима на заключительных стадиях нейрогенеза для полного подавления программы экспрессии генов нейральной дифференцировки и стимулирования экспрессии генов, специфичных для глии [17].

    Белок Tgfb2 (transforming growth factor beta 2) выявлен в фоторецепторах, глии Мюллера, ганглиозных клетках нативной сетчатки, в РПЭ и сосудистой оболочке и не обнаружен в зрительном нерве сетчатки глаза тритона. В хрусталике нативного глаза Tgfb2 был выявлен в эпителии и не обнаружен в волокнах хрусталика. В регенерирующей сетчатке белок обнаружен в нейробластах, макрофагах в полости глаза, а затем в дифференцирующихся ганглиозных клетках, фоторецепторах. Выявлено снижение иммунопозитивного сигнала для этого белка в клетках сетчатки на продвинутых стадиях регенерации. В клетках глии Мюллера P. waltl усиление иммунопозитивного сигнала не было зарегистрировано. Ранее показано возрастание активности Tgfb2 в клетках глии Мюллера у рыб (zebrafish), которые служат источником регенерации фоторецепторов и ганглиозных клеток при регенерации сетчатки. В сетчатке этого вида Tgfb2 служит фактором поддержания пролиферативной активности клеток и нейрогенеза [18]. В сетчатке человека экспрессия TGFbeta2 коррелирует с последовательностью дифференцировки ганглиозных клеток, фоторецепторов [19].

    TGF-β2 секретируемый клетками РПЭ, поддерживает жизнеспособность этих клеток при макулярной дистрофии сетчатки [20]. Обработка фактором TGF-β2 снижает гибель ганглиозных клеток сетчатки in vitro у млекопитающих. TGF-β оказывает противоположный эффект на клетки РПЭ на начальной и продвинутой стадии неоваскулярной формы ВМД [21]. Физиологически низкие уровни аутокринного TGF-β2 могут быть необходимы для гомеостаза клеток РПЭ сетчатки. Потеря эпителиальной целостности и полярности клеток РПЭ в результате отслойки фоторецепторов вызывает повышенную секрецию TGF-β2 в РПЭ и клетках глии млекопитающих. Это в свою очередь способствует ЭМП, при котором клетки РПЭ теряют эпителиальную морфологию и функции, проявляют тенденцию к миграции, участию к формированию фиброваскулярных мембран совместно с клетками глии, стекловидного тела [22]. Снижение уровня Tgfb2 в РПЭ и низкий уровень в клетках глии поврежденной сетчатки хвостатых амфибий могут быть связаны с тем, что у этих животных не выражен ЭМП, блокирующий регенерацию.

    Проведено сопоставление локализации белков Bmp4, Tgfb2, Fgf2 в нативных тканях и регенерирующей сетчатке. Результаты показали, что иммунопозитивный сигнал Fgf2 (fibroblast growth factor-2) в отличие от Bmp4 и Tgfb2 характеризуется более высокой интенсивностью в клетках нативной ткани сетчатки. В нативной сетчатке иммунопозитивный сигнал Fgf2 выражен в НЯС (фоторецепторы), клетках ганглиозного слоя сетчатки, зрительном нерве и РПЭ. Иммунопозивный сигнал Fgf2 поддерживается на высоком уровне в нейробластах регенерирующей сетчатки, которые активно пролиферируют. В ходе регенерации сетчатки иммунопозивный сигнал выявлен преимущественно в клетках ганглиозного слоя и фоторецепторах. В предыдущих исследованиях было обнаружено подавление экспрессии гена Fgf2 и снижение интенсивности иммунохимической реакции белка Fgf2 в ранние сроки вскоре после удаления сетчатки у взрослых тритонов [23]. Белки семейства FGF (FGF1, FGF2) индуцируют экспрессию нейральных генов и вовлечены в инициацию и контроль процессов нейрогенеза [24, 25]. При повреждении тканей bFGF (Fgf2) выполняет роль митогена в заживлении ран. Выраженная иммунореактивность к bFGF была обнаружена в слое ганглиозных клеток, а слабая иммунореактивность к bFGF – в РПЭ нативной сетчатке взрослой крысы. В то же время при повреждении сетчатки после лазерной фотокоагуляции интенсивную иммунореактивность к bFGF наблюдали в ядрах и цитоплазме пролиферирующих клеток РПЭ. Макрофаги, которые мигрировали в область повреждения сетчатки, также показали положительное окрашивание на bFGF.

    Количество иммунопозитивных клеток и интенсивность сигнала к bFGF снижались с течением регенерации сетчатки [26].

    Cигнальные белки могут быть связаны прямо или косвенно в механизмах передачи сигналов. Сигнализация BMP регулирует путь FGF в процессе регенерации сетчатки глаза эмбрионов кур из клеток РПЭ. Сигналы BMP индуцируют пролиферацию клеток-предшественников регенерирующей сетчатки на ранней стадии регенерации посредством активации Smad (канонический путь BMP) и повышения регуляции сигнализации FGF путем MAPK и апоптоз на поздней стадии регенерации посредством сложного перекрестного взаимодействия с сигнальным путем FGF активации p38 (неканонический путь BMP) и снижения FGF (через MAPK, или AKT) [11].

    Сравнительный биоинформационный анализ сигнальных путей Tgfb и Bmp4 в клетках РПЭ человека выявил общие для обоих сигнальных путей и специфические гены, участвующие в ЭМП (рис. 1). Полученные результаты вносят дополнение в молекулярную характеристику клеток РПЭ при регенерации и при РПЭ-зависимых состояниях сетчатки, связанных с ЭМП.

    Заключение

    Сигнальные пути эволюционно консервативны и инвариантны по отношению к тканевой дифференцировке, что обеспечивает специфичные для типа клеток биологические эффекты. Сигнальные пути характеризуются сложными перекрестными взаимодействиями, могут иметь общие мишени, связывающие разные сигнальные каскады. Одни и те же сигнальные пути у разных видов могут реализовываться через разные мишени и цепочки реакций, а ключевые их компоненты, сигнальные белки – иметь видовую специфичность, что может объяснять различия биологических ответов. Полученные результаты ставят задачи изучения влияния сигнальных путей со стороны взаимодействующих тканей, анализ специфичности компонентов сигнальных путей, молекулярного состава и свойств «секретомов» взаимодействующих тканей в процессе регенерации и дегенерации сетчатки. Понимание сигнальных механизмов, контролирующих дифференцировку и жизнеспособность клеток ретинального пигментного эпителия и нейронов сетчатки, имеет биомедицинское значение, так как дает возможность управления этими процессами.

    Работа выполнена при поддержке государственной программы ИБР РАН No. 0088-2024-0014 с использованием оборудования ЦКП ИБР РАН.